核因子κB在未分化甲狀腺癌化療耐藥機(jī)制和治療中的作用.pdf

1、核因子κB（NF-κB）在癌細(xì)胞生長、增殖以及化療耐藥性的發(fā)生過程中起了重要作用，以DHMEQ為代表的NF-κB抑制劑通過對NF-κB的抑制而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，并可以增加腫瘤對化療的敏感性。截止到2008年10月，從Medline的數(shù)據(jù)庫中沒有檢索到針對甲狀腺癌聯(lián)合應(yīng)用NF-κB抑制劑和紫杉烷進(jìn)行體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)報(bào)道。 目的：提出并建立未分化甲狀腺癌（ATC）化療耐藥機(jī)制的NF-κB誘導(dǎo)理論，并運(yùn)用體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)根據(jù)該原

2、理將分子靶向性強(qiáng)的NF-κB抑制劑與紫杉烷類化療藥物進(jìn)行聯(lián)合的增敏效果和可行性。 方法：應(yīng)用細(xì)胞存活分析法研究單獨(dú)或聯(lián)合使用不同濃度紫杉醇、多烯紫杉醇和DHMEQ后ATC細(xì)胞（FRO和ARO兩個(gè)細(xì)胞系）的凋亡情況，并進(jìn)一步確定細(xì)胞學(xué)水平實(shí)驗(yàn)中所采用的各自藥物濃度。通過DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析藥物作用后核內(nèi)NF-κB與其特異的雙鏈寡聚核苷酸探針的結(jié)合能力的變化情況；應(yīng)用Western blot鑒定藥物作用后ATC細(xì)胞NF-κB核蛋白表達(dá)

3、的變化。應(yīng)用Western blot鑒定藥物作用后ATC細(xì)胞內(nèi)凋亡關(guān)鍵因子（PARP、caspase3、XIAP和survivin）蛋白表達(dá)的變化。采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色及流式細(xì)胞儀技術(shù)進(jìn)一步鑒定藥物作用后ATC細(xì)胞的凋亡變化。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中首先進(jìn)行了確定多烯紫杉醇劑量的兩組預(yù)實(shí)驗(yàn)，在正式的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中將裸鼠隨機(jī)分為4組（多烯紫杉醇組、DHMEQ組、聯(lián)合用藥組和對照組），使用預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定的藥物劑量進(jìn)行腹腔內(nèi)（i．p

4、．）注射，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的整個(gè)觀察周期為32天；在停藥后的第一天從不同治療方案的四組中各任意選取一只裸鼠處死、取下瘤體做TUNEL凋亡染色和凋亡指數(shù)的計(jì)算。 結(jié)果：①ATC細(xì)胞的存活分析顯示存活細(xì)胞數(shù)目和藥物的濃度均呈反比，藥物聯(lián)合應(yīng)用比單一用藥更有效、存活細(xì)胞數(shù)顯著減少（統(tǒng)計(jì)結(jié)果有顯著性差異），且FRO比ARO對藥物更敏感些。此外，確定了細(xì)胞學(xué)水平實(shí)驗(yàn)中采用的紫杉烷和DHMEQ濃度分別為4nM和10μg/ml。②DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示單

5、用多烯紫杉醇時(shí)結(jié)合能力隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，DHMEQ聯(lián)合多烯紫杉醇時(shí)結(jié)合能力明顯受到抑制（統(tǒng)計(jì)結(jié)果有顯著性差異），尤其是前8個(gè)小時(shí)。對紫杉烷作用4小時(shí)后的核蛋白進(jìn)行Western blot，顯示NF-κB濃度增高，而DHMEQ抑制NF-κB向核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，會(huì)使其核蛋白濃度降低，聯(lián)合用藥時(shí)仍可以抑制紫杉烷導(dǎo)致NF-κB的升高。③Western blot顯示紫杉烷作用24小時(shí)后總蛋白中的關(guān)鍵凋亡因子capsase3的活化水解產(chǎn)物、PARP的失活裂

6、解產(chǎn)物明顯增多，DHMEQ亦可使二者的水解產(chǎn)物升高，但聯(lián)合用藥時(shí)二者升高得更為顯著；24小時(shí)時(shí)程的變化顯示細(xì)胞總蛋白capsase3的活化水解產(chǎn)物、PARP的失活裂解產(chǎn)物逐漸升高，且DHMEQ誘導(dǎo)凋亡的作用更為迅速，在很早的時(shí)程內(nèi)就可使二者大量出現(xiàn)。此外，ATC細(xì)胞對凋亡拮抗因子XIAP和survivin的基礎(chǔ)表達(dá)就比較明顯，紫杉烷作用24小時(shí)后這兩者表達(dá)水平均升高，但DHMEQ可使XIAP和survivin明顯降低，聯(lián)合用藥時(shí)仍然是減

7、低的，說明DHMEQ可以有效地抑制ATC細(xì)胞本身固有的和由于NF-κB增高而誘導(dǎo)進(jìn)一步增高的凋亡拮抗因子。④流式細(xì)胞儀的結(jié)果顯示雖然單獨(dú)使用多烯紫杉醇和DHMEQ都會(huì)誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生，但是聯(lián)合用藥后被Annexin V和PI陽性標(biāo)記的細(xì)胞顯著升高。⑤動(dòng)物預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了多烯紫杉醇使用的劑量為5 mg/kg（第5和12天i．p．注射），DHMEQ使用劑量為6mg/kg/day（第5-18天i．p．注射），聯(lián)合用藥組兩藥和用、劑量同上，對照組i．p

8、．注射1：1體積比的DMSO和PBS；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果顯示雖然單獨(dú)使用藥物可以抑制移植瘤體的生長，但是聯(lián)合用藥能獲得更顯著的抑制效果（統(tǒng)計(jì)結(jié)果有顯著性差異）；TUNEL凋亡染色和凋亡指數(shù)亦顯示聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥能更顯著地增加凋亡染色陽性細(xì)胞的數(shù)目（統(tǒng)計(jì)結(jié)果有顯著性差異）。 結(jié)論： 1．本研究證實(shí)紫杉烷類藥物會(huì)誘導(dǎo)ATC細(xì)胞NF-κB的增高、從而削弱紫杉烷的療效（即存在著NF-κB誘導(dǎo)機(jī)制），而NF-κB抑制劑DHMEQ可

9、以有效地抑制這種現(xiàn)象。 2．在細(xì)胞學(xué)的水平上證明雖然單獨(dú)使用紫杉烷和DHMEQ均可以抑制ATC細(xì)胞的增殖，但聯(lián)合用藥時(shí)對凋亡的誘導(dǎo)有協(xié)同效應(yīng)。 3．進(jìn)行了應(yīng)用多烯紫杉醇治療ATC的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，并在裸鼠體內(nèi)首次嘗試NF-κB抑制劑和多烯紫杉醇聯(lián)合治療ATC腫瘤，結(jié)果證實(shí)聯(lián)合用藥可以更有效地抑制瘤體的增長、有協(xié)同效應(yīng)。 4．上述體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明：在ATC細(xì)胞化療耐藥產(chǎn)生過程中存在著NF-κB誘導(dǎo)機(jī)制。根據(jù)該原理將分子