miRNA-1和miRNA-499誘導心臟肌成纖維細胞向心肌樣細胞直接轉(zhuǎn)分化的實驗研究.pdf

1、目的：篩選心臟肌成纖維細胞(cardiac myofibroblasts，CMFs)與心肌細胞(cardiomyocytes，CMs)中差異表達的miRNAs，通過轉(zhuǎn)入特定miRNAs(miRNA-1、miRNA-499)，誘導新生小鼠心臟肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為心肌樣細胞。
　　方法：體外培養(yǎng)新生小鼠心臟成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs），常氧培養(yǎng)傳代至P2;37℃低氧(3％O2)培養(yǎng)48h;免疫熒光染色檢

2、測CFs特異性標記物波形蛋白(vimentin)的表達，免疫熒光染色、流式細胞技術(shù)檢測CFs向CMFs表型轉(zhuǎn)化的標記物α-平滑肌激動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達。
　　采用miRNA芯片檢測CMFs與心肌細胞中miRNA的表達差異;real-timeqPCR方法驗證芯片檢測結(jié)果。實驗分為4組:①miRNA-1轉(zhuǎn)染組;②miRNA-499轉(zhuǎn)染組;③miRNA-1+miRNA-499共轉(zhuǎn)染組;④

3、空白對照組。以慢病毒為載體，將miRNAsmiRNA-1、miRNA-499轉(zhuǎn)染CMFs，提取轉(zhuǎn)染病毒細胞總RNA，real-time qPCR檢測心臟發(fā)育不同階段特異性因子Isl1、Mesp1、Tbx5、Mef-2c、Gata4、α-MHC和cTnT的表達。
　　結(jié)果：1.Vimentin特異性表達于CFs，免疫熒光染色觀察vimentin表達，結(jié)果表明CFs純度為97％。2.CFs常氧傳代至P2代，37℃低氧(3％O2)培養(yǎng)4

4、8h，免疫熒光雙染色觀察vimentin和α-SMA，流式細胞技術(shù)檢測α-SMA表達量。結(jié)果顯示，α-SMA特異性表達于CMFs，CFs轉(zhuǎn)化為CMFs效率為96.8％。3.miRNA芯片分析了心肌細胞與CMFs中miRNA的表達差異，結(jié)果表明17條miRNA在心臟肌成纖維細胞與心肌細胞中表達差異顯著，上調(diào)11條，下調(diào)6條，結(jié)果表明，miRNA-1和miRNA-499在心肌細胞中高表達。4.選擇兩個高表達的miRNAs（miRNA-1、m

5、iRNA-499）進行實時熒光定量PCR分析，與CMFs相比，心肌細胞中miRNA-1和miRNA-499表達量顯著增加(P＜0.05)與芯片結(jié)果一致。5.CMFs中過表達miRNA-1、miRNA-499后，心臟發(fā)育不同階段特異性因子發(fā)生不同程度的表達變化（與空白對照組相比，其余三組GATA4、Tbx5、Mef-2c、α-MHC表達明顯增高，Mea1、Isl1表達均無顯著變化）。
　　結(jié)論：1.心臟肌成纖維細胞與心肌細胞有不同的