冬蟲夏草原生質(zhì)體育種及液體富Zn、Se、Ge研究.pdf

1、冬蟲夏草(Cordycepssinensis)目前難以規(guī)?；斯ぴ耘啵饕砸吧x夏草為主，過渡的濫采濫收造成資源稀少，生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，同時也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需要。而蟲草菌絲體中主要功效成分與野生冬蟲夏草相當(dāng)，且人工液體培養(yǎng)蟲草菌絲體具有周期短、易控制、成本低、重復(fù)性好等優(yōu)點。因此本課題對冬蟲夏草菌絲體進(jìn)行原生質(zhì)體制備與再生，優(yōu)化單酶或復(fù)合酶酶解條件，利用原生質(zhì)體誘變技術(shù)，選育多糖高產(chǎn)量冬蟲夏草誘變菌株，并以誘變菌株為載體，進(jìn)行

2、Zn、Se、Ge單元素和三元素富集，優(yōu)化富集條件，以小白鼠為試材，對谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathioneperoxidsade，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)等抗氧化指標(biāo)進(jìn)行初步檢測，得到了以下結(jié)論： 1、冬蟲夏草液體培養(yǎng)基最佳組成為：馬鈴薯20％，葡萄糖2％，酵母粉0.2％，水1000mL，pH6.0。在此條件下，25℃、

3、160r/min振蕩培養(yǎng)4d，生物量達(dá)到1.72g/100mL。 2、研究了不同酶系統(tǒng)、酶濃度、酶解溫度、酶解時間、穩(wěn)滲劑、pH值、培養(yǎng)時間對冬蟲夏草原生質(zhì)體形成的影響。結(jié)果表明，在30℃、pH6.0、1.5％溶壁酶條件下，以0.6mol/L氯化鉀作為穩(wěn)滲劑，酶解3h，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到4.35×107個/mL。 3、冬蟲夏草原生質(zhì)體適宜再生培養(yǎng)基為：麥芽糖2％，葡萄糖2％，蛋白胨0.2％，酵母粉0.40％，KH2PO40

4、.20％，MgSO4·7H2O0.15％，維生素B10.001％，維生素B60.001％。再生率達(dá)到38.07％。 4、冬蟲夏草原生質(zhì)體紫外線輻射至半致死率的照射時間約為20s。根據(jù)拮抗反應(yīng)和生長狀況，篩選出100株冬蟲夏草原生質(zhì)體紫外線誘變菌株，以原始出發(fā)菌株為對照，從中篩選出10株蟲草多糖含量高于原始出發(fā)菌株的誘變菌株，編號為024、029、035、036、055、071、078、086、089、098。將10株誘變菌株及原

5、始出發(fā)菌株分別連續(xù)傳代10次，以出發(fā)菌株為對照，從中篩選出1株多糖含量更高的誘變菌株，編號為035。 5、誘變菌株優(yōu)化培養(yǎng)基為：馬鈴薯20％，葡萄糖2％，酵母粉0.4％，KH2PO40.2％，MgSO4·7H2O0.15％，菌絲體生物量達(dá)到1.260g/100mL。最佳發(fā)酵條件為：pH值6.5、溫度25℃、接種量5％、轉(zhuǎn)速120r/min。 6、冬蟲夏草誘變菌株能夠有效地對Zn、Se、Ge進(jìn)行富集和轉(zhuǎn)化，而且在較低濃度時

6、能夠促進(jìn)菌絲體的生長。培養(yǎng)基中適宜的Zn、Se、Ge添加濃度分別為150μg/mL、60μg/mL、50-1000μg/mL。 7、初步確定了培養(yǎng)基中三種元素之間最佳濃度配比，即Zn：100μg/mL，Se：20μg/mL，Ge：200μg/mL。三者之間的相互關(guān)系為：Se、Ge濃度的升高能夠促進(jìn)菌絲對Zn的吸收，具有協(xié)同效應(yīng)；Zn、Ge和Se之間不存在競爭，也無協(xié)同作用；而低濃度的Zn、Se對Ge的富集有抑制作用，較高濃度的Z

7、n、Se對Ge的富集有促進(jìn)作用。 8、對富Zn、Se、Ge菌絲體多糖的研究表明，用熱水抽提的菌絲體多糖含有三種組分，其單糖組成為半乳糖、葡萄糖和甘露糖。 9、以灌胃蒸餾水為對照，研究了富Zn、Se、Ge冬蟲夏草菌粉組、富Zn菌粉組、富Se菌粉組、富Ge菌粉組的小鼠全血的谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和丙二醛含量的影響。結(jié)果表明，富Zn、Se、Ge冬蟲夏草菌粉組小鼠全血GSH-Px的活性明顯增加，12d時最高，分別是對

8、照組的1.037倍、富Zn菌粉組的1.002倍、富Ge菌粉組的1.007倍、富Se菌粉組的1.002倍。 10、富Zn、Se、Ge冬蟲夏草菌粉組小鼠全血SOD的活性也明顯增加，12d時最高，分別是對照組的1.287倍、富Ge菌粉組的1.553倍、富Se菌粉組的1.381倍，而富Zn菌粉組是富Zn、Se、Ge組的1.054倍。 11、富Zn、Se、Ge冬蟲夏草菌粉組小鼠全血MDA含量明顯降低，18d時最低，分別比對照組降低