TP53基因改變影響MDM2抑制劑對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、背景目的：
　　 神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有生長迅速、浸潤性生長、惡性程度高、病程短、手術(shù)后易復(fù)發(fā)、預(yù)后很差等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著人民群眾的健康。神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生的原因以及發(fā)生發(fā)展的機(jī)制還有很多待研究之處。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與基因改變密切相關(guān)，而且存在一個(gè)基因改變和病變效應(yīng)的不斷積累、演化的過程。而基因改變中，癌基因和腫瘤抑制基因發(fā)揮的作用最為關(guān)鍵。腫瘤細(xì)胞中癌基因可以通過多種方式異常激活，同樣，抑癌基因也可以通過多種方式

2、異常失活。同時(shí)，不同個(gè)體腫瘤又在基因改變、藥物敏感性上具有很大差異。抑癌基因TP53的表達(dá)產(chǎn)物p53蛋白在細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞基因組完整性的維持、誘發(fā)細(xì)胞分化和凋亡中起著重要的作用。P53 信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用。P53 信號通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中也扮演著極其關(guān)鍵的作用。MDM2 對p53蛋白水平具有重要的調(diào)控作用，而且這種調(diào)控作用與TP53基因狀態(tài)密切相關(guān)，因此，本研究著重探討MDM2 特異性小分子抑制劑Nu

3、tlin-3對具有不同TP53基因狀態(tài)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用和機(jī)制，為Nutlin-3的臨床應(yīng)用以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤的個(gè)體化治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 采用RT-PCR 方法克隆出神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、A172和U251中TP53基因轉(zhuǎn)錄出的cDNA，采用DNA測序方法確定其基因是否有改變。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用Nutlin-3處理三種細(xì)胞，使用MTT 方法測定細(xì)胞活力，明確Nutlin-3 對三種細(xì)胞作用的差異；

4、r>　　 采用MTT法檢測Nutlin-3 聯(lián)合PI3K 抑制劑LY294002 應(yīng)用對三種膠質(zhì)瘤的作用。應(yīng)用RT-PCR 定量方法確定三種細(xì)胞用藥前后p53以及p53 靶基因MDM2、BAX和P21 mRNA表達(dá)量的差異，應(yīng)用Western-blot 方法檢測p53蛋白、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）
　　 和核增殖抗原（PCNA）用藥前后量的變化，應(yīng)用Oligonucleotide pull-down 方法檢測三種細(xì)

5、胞中p53蛋白的DNA 結(jié)合活性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、克隆到的TP53基因cDNA片段經(jīng)測序后確定，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中TP53基因沒有突變，屬于野生型；而A172 細(xì)胞系發(fā)生N239S 改變，U251 細(xì)胞系發(fā)生R273H改變。
　　 2、MTT 細(xì)胞活力測定實(shí)驗(yàn)顯示：MDM2 抑制劑Nutlin-3能夠明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87（25 μM，抑制率為36.97％）、A172（25 μM，61.

6、41％）的生長，而對U251（25 μM，-18.27％）細(xì)胞沒有明顯作用；PI3K 抑制劑LY294002 對三種膠質(zhì)瘤細(xì)胞在較高濃度下均有作用；Nutlin-3 聯(lián)合LY294002 處理，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)使用Nutlin-3 或LY294002。
　　 3、RT-PCR 半定量實(shí)驗(yàn)顯示：使用Nutlin-3 處理前后，神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞p53mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，而處理后U87、A172

7、 細(xì)胞中p53 mRNA表達(dá)水平顯著升高（p<0.01）；用藥處理前后，U251 細(xì)胞中p53 靶基因P21和BAXmRNA表達(dá)水平?jīng)]有太大變化，MDM2基因mRNA表達(dá)水平略有升高，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而處理后U87 細(xì)胞中p53 靶基因MDM2，P21和BAXmRNA表達(dá)水平明顯升高（p<0.05）；A172細(xì)胞中p53 靶基因MDM2，P21 mRNA表達(dá)水平顯著升高（p<0.01），BAXmRNA表達(dá)水平明顯升高（p<0.05）。

8、
　　 4、Western-blot 實(shí)驗(yàn)表明：無藥物處理時(shí)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞中p53蛋白水平顯著高于U87和A172 細(xì)胞（p<0.01）；Nutlin-3 處理后，U251 細(xì)胞中p53蛋白水平略有提高但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而用藥處理后U87、A172 細(xì)胞中p53蛋白水平顯著升高（p<0.01），A172 細(xì)胞升高尤其顯著；藥物處理后，細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白PARP 在U87和U251 細(xì)胞中沒有明顯變化，而在A172 細(xì)胞

9、中檢測到少量caspase 切割后片段；細(xì)胞增殖標(biāo)志蛋白PCNA 在U251和A172 細(xì)胞中的水平?jīng)]有明顯變化，而在U87 細(xì)胞中顯著降低（p<0.01）。
　　 5、Oligonucleotide pull-down 實(shí)驗(yàn)顯示：U87 細(xì)胞中野生型p53能夠結(jié)合特定DNA序列，而且A172 細(xì)胞中N239S 改變型p53蛋白亦具備結(jié)合活性，只有U251 細(xì)胞中R273H 突變型p53蛋白不具備DNA 結(jié)合活性。
　　

10、 結(jié)論：
　　 1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞TP53基因狀態(tài)不同，MDM2 特異性小分子抑制劑Nutlin-3的作用有明顯差別，提示臨床治療依據(jù)TP53基因狀態(tài)決定MDM2 抑制劑使用的必要性。
　　 2、PI3K 抑制劑在較大濃度下對三種神經(jīng)膠質(zhì)瘤均有一定作用，MDM2 抑制劑聯(lián)合PI3K 抑制劑的作用明顯增加。
　　 3、A172 細(xì)胞中TP53基因的改變不影響MDM2 抑制劑的作用，說明該改變并沒有改變p53蛋白的功

11、能，Oligonucleotide pull-down 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步支持該結(jié)論。
　　 4、MDM2 抑制劑通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖（PCNA 改變）、促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡（BAX改變及PARP 變化）發(fā)揮作用。
　　 5、MDM2 抑制劑處理減少p53 降解，p53蛋白水平增加導(dǎo)致靶基因表達(dá)水平增加，增加的MDM2 會消掉MDM2 抑制劑的部分作用，而增加的P21 會進(jìn)一步抑制MDM2的作用，提示p53-MDM2 反