蛋白激酶B抑制劑派立福辛聯(lián)合神經(jīng)酰胺C6抗人腦膠質(zhì)瘤的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　觀察蛋白激酶B抑制劑哌立福辛(perifosine)、神經(jīng)酰胺C6(ceramide)對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、自噬等生物學(xué)行為的影響，探討哌立福辛與神經(jīng)酰胺C6聯(lián)合用藥的協(xié)同機(jī)制，為腦膠質(zhì)瘤的靶向治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.對膠質(zhì)瘤細(xì)胞予以不同濃度及時(shí)間的哌立福辛處理，運(yùn)用MTT法及細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞增殖活性；組蛋白 DNA ELISA法及Annexin V/PI雙染法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡改

2、變；Western-Blot法檢測AKT1、p-AKT、p-S6、p-AMPKα、p-ACC以及ATG-5、LC-3B、Beclin-1的表達(dá)情況；高效液相色譜法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的水平的變化。
　　2.對膠質(zhì)瘤細(xì)胞予以不同濃度及時(shí)間的神經(jīng)酰胺 C6處理，MTT法檢測其對細(xì)胞活力的影響；神經(jīng)酰胺C6、哌立福辛以及二者聯(lián)合處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞，運(yùn)用MTT法、Trypan blue實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞活性改變；Western-Blot法檢

3、測ERK、p-AKT、p-S6、p-S6K、p-ERK以及ATG-5、LC-3B、Beclin-1的表達(dá)情況。
　　3.運(yùn)用自噬抑制劑3-MA、氯喹（Cq）和caspase抑制劑z-VAD-fmk對上述各組細(xì)胞予以干預(yù)，檢測腫瘤的細(xì)胞活力變化；對膠質(zhì)瘤細(xì)胞予以3-MA聯(lián)合哌立福辛處理，MTT法檢測腫瘤細(xì)胞活性，組蛋白 DNA ELISA法及Annexin V/PI雙染法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡改變；同樣方法檢測神經(jīng)酰胺C6聯(lián)合哌立福辛對膠

4、質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.構(gòu)建ATG5-siRNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞株建立自噬缺陷細(xì)胞；MTT法檢測哌立福辛及神經(jīng)酰胺C6對自噬缺陷細(xì)胞活性影響，Annexin V/PI雙染法檢測其凋亡改變。
　　結(jié)果：
　　1. MTT法和細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示哌立福辛顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，其抑制效應(yīng)呈時(shí)間和濃度依賴性；Annexin V/PI雙染法及組蛋白DNA ELISA法提示哌立福辛能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，但誘導(dǎo)作用不明

5、顯；Western-Blot法檢測到哌立福辛下調(diào)p-AKT的表達(dá)，上調(diào)自噬相關(guān)蛋白ATG-5、LC-3B、Beclin-1蛋白表達(dá)；高效液相色譜法結(jié)果顯示哌立福辛能夠輕度提高細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的水平。
　　2. MTT法以及Trypan blue實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示神經(jīng)酰胺C6聯(lián)合哌立福辛對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制具有協(xié)同效應(yīng)；組蛋白DNA ELISA法及Annexin V/PI雙染法結(jié)果表明膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)顯著增加；Western-Blot法結(jié)

6、果表明聯(lián)合用藥抑制自噬相關(guān)蛋白ATG-5、LC-3B、Beclin-1蛋白表達(dá)，對p-AKT影響不明顯。
　　3.自噬抑制劑3-MA，Cq顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性，但抑制作用可被z-VAD-fmk阻斷，3-MA可增強(qiáng)哌立福辛對膠質(zhì)瘤的細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)；組蛋白 DNA ELISA法及 Annexin V/PI雙染法顯示神經(jīng)酰胺C6可顯著增強(qiáng)哌立福辛對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)，z-VAD-fmk可阻斷聯(lián)合用藥的協(xié)同作用。
　　4.成功

7、構(gòu)建自噬缺陷細(xì)胞；哌立福辛對自噬缺陷細(xì)胞的增殖抑制作用顯著增強(qiáng)，聯(lián)合神經(jīng)酰胺C6未見明顯的協(xié)同效應(yīng)；Annexin V/PI雙染法檢測結(jié)果顯示哌立福辛對自噬缺陷細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　1.哌立福辛有望作為膠質(zhì)瘤分子靶向治療治療藥物候選之一，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　2.神經(jīng)酰胺C6增強(qiáng)哌立福辛對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用，具有協(xié)同效應(yīng)。
　　3.協(xié)同作用的機(jī)制是派立福辛抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的同時(shí)誘