灰樹花子實(shí)體多糖的分離純化及免疫活性研究.pdf

1、灰樹花(Grifola frondosa)是一種生長在亞熱帶至溫帶的名貴珍稀藥食兩用真菌，又名貝葉多孔菌、云蕈、舞茸。在我國河北、浙江、四川、吉林、福建等省均有分布，并且在浙江、河北等省已實(shí)現(xiàn)規(guī)?；耘?，產(chǎn)量逐年增加。中醫(yī)認(rèn)為灰樹花有“扶正固本”之效，東漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其“調(diào)和脾胃，安定神志”的功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，灰樹花多糖具有顯著的抗癌、保肝、降血壓、提高免疫力等諸多藥理活性?；覙浠ǖ臓I養(yǎng)和藥用價(jià)值，正引起愈來愈多學(xué)者的

2、關(guān)注。本文對灰樹花多糖進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)的初步分析，追蹤檢測了所得各個(gè)灰樹花多糖的免疫活性，獲得具有免疫活性的灰樹花均一多糖，并深入探討了灰樹花均一多糖對巨噬細(xì)胞的活化作用，以期為灰樹花中藥資源和天然免疫藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　 第一部分，灰樹花子實(shí)體多糖的提取和分離純化。采用熱水提取、乙醇分級沉淀法獲得灰樹花子實(shí)體粗多糖GFP75、GFP50和GFP30三個(gè)部分；利用DEAE-Seoharose FastFlow離子柱

3、層析對粗多糖GFP75進(jìn)行純化，利用梯度洗脫的方法，得到GFP75-1、GFP75-2、GFP75-3、GFP75-4、GFP75-5和GFP75-6等六個(gè)灰樹花多糖組分；選取多糖GFP75-2、GFP75-3和GFP75-4進(jìn)行Sephacryl S系列凝膠柱層析(GFP75-3先經(jīng)離子柱層析再進(jìn)行凝膠柱層析)，獲得四個(gè)灰樹花多糖，即GFP75-2C、GFP75-2D、GFP75-3C1、GFP75-4B；利用HPLC法檢測其純度，結(jié)

4、果顯示，所得四個(gè)灰樹花多糖為均一多糖。
　　 第二部分，灰樹花均一多糖的結(jié)構(gòu)初步解析。采用現(xiàn)代色譜和光譜技術(shù)對得到的均一多糖進(jìn)行了初步結(jié)構(gòu)分析。高效液相色譜(HPLC)檢測結(jié)果顯示四個(gè)均一多糖GFP75-2C、GFP75-2D、GFP75-3C1、GFP75-4B的分子量分別是1.6×104Da、3×103Da、7.1×104Da和4.2×105Da。紫外光譜(UV)表明四種均一多糖均不含蛋白質(zhì)和核酸等成分。運(yùn)用高效陰離子色譜(

5、HPAEC)、紅外光譜(IR)和核磁共振(NMR)技術(shù)分析了四個(gè)均一多糖的糖環(huán)構(gòu)型和單糖組成，結(jié)果顯示灰樹花多糖GFP75-2C是含有巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖的α-吡喃型中性雜多糖，灰樹花多糖GFP75-2D是含有巖藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖的呋喃型中性多糖，灰樹花多糖GFP75-3C1是含有巖藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的酸性多糖，灰樹花多糖GFP75.4B是含有巖藻糖、鼠李糖、半乳糖、

6、葡萄糖、甘露糖的中性多糖。
　　 第三部分，灰樹花子實(shí)體多糖的免疫活性研究。運(yùn)用活性追蹤的方法，利用巨噬細(xì)胞分泌NO實(shí)驗(yàn)和小鼠淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)追蹤檢測了分離純化過程中得到的各個(gè)組分的免疫活性。粗多糖GFP75經(jīng)體外刺激巨噬細(xì)胞分泌NO實(shí)驗(yàn)和刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明，其具有一定的體外免疫活性；通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)粗多糖GFP75-1、GFP75-2、GFP75-3、GFP75-4、GFP75-5和GFP75-6均有免疫活性，

7、其中，GFP75-2、GFP75-3和GFP75-4對巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞皆具有免疫活性，對這三個(gè)組分進(jìn)一步純化獲得的四個(gè)均一多糖中，除灰樹花多糖GFP75-2C外，均有免疫活性，與相應(yīng)的DEAE離子柱組分相比，灰樹花多糖GFP75-2D刺激巨噬細(xì)胞分泌NO活性顯著提高，灰樹花多糖GFP75-3C1刺激巨噬細(xì)胞分泌NO活性和刺激淋巴細(xì)胞增殖活性稍有提高，灰樹花多糖GFP75-4B刺激巨噬細(xì)胞分泌NO活性有所降低。
　　 第四部分，

8、灰樹花均一多糖GFP75-2D對巨噬細(xì)胞的活化作用研究。選取體外免疫活性顯著的灰樹花均一多糖GFP75-2D，研究了其對巨噬細(xì)胞免疫的活性機(jī)制。采用Griess法測定了灰樹花多糖對巨噬細(xì)胞NO釋放量的影響，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測了灰樹花多糖對巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響，RT-PCR法檢測灰樹花多糖對巨噬細(xì)胞表達(dá)相關(guān)細(xì)胞因子mRAN表達(dá)量的影響。研究發(fā)現(xiàn)，灰樹花多糖GFP75-2D對巨噬細(xì)胞有活化作用，刺激細(xì)胞體積變大，形成偽

9、足；與陰性對照相比，灰樹花多糖GFP75-2D處理后的RAW264.7細(xì)胞NO釋放量顯著增加，并且NO的釋放量與灰樹花多糖存在劑量依賴性；與未經(jīng)樣品刺激組相比，灰樹花多糖GFP75-2D處理后的RAW264.7細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6等細(xì)胞因子的量明顯增多，同時(shí)TNF-α、IL-1β和IL-6等細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量也增多。表明灰樹花多糖GFP75-2D能夠多途徑激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的生物活性，具有良好的免疫增