水稻矮縮病毒Pns10和Pns11基因的原核表達(dá)及抗血清制備.pdf

1、福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文水稻矮縮病毒Pns10和Pns11基因的原核表達(dá)及抗血清制備姓名：林宇巍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：吳祖建20060401福建農(nóng)林人學(xué)碩= I ? 學(xué)位論文摘要水稻矮縮病毒( R i c e d w a 礦v i r u s ，R D V ) 是呼腸孤病毒科( R e o v i r i d a e ) 植物呼腸孤病毒屬( P h y t o r e o v i r u s ) 的成員，能引起水稻

2、矮縮病。最早于1 8 8 3 年，在日本首先被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)今主要流行于日本、朝鮮、東南亞以及我國(guó)東南部等水稻產(chǎn)區(qū)，對(duì)水稻生產(chǎn)造成一定影響。R D V 基因組包括1 2 條雙鏈R N A 片段( s l - s 1 2 ) ，本文通過(guò)對(duì)云南R D V 分離物基因組S ／O 和剮，片段編碼區(qū)克隆，原核表達(dá)并制備了P n s l O 和P n s l l 融合蛋白的抗血清，為進(jìn)一步研究基因的功能奠定了基礎(chǔ)。利用T r i z o l 法從感病水稻

3、葉片中獲取該病毒的全基因組，根據(jù)R D V 福建分離株( R D V - F ) S ／O 開(kāi)放閱讀框( O F F ) 核苷酸序歹O ( n t l 4 —1 0 7 5 ) 和S l l 丌放閱讀框核苷酸序列( n t 3 0 ．5 7 5 ) 分別設(shè)計(jì)含有合適酶切位點(diǎn)的引物，通過(guò)R T - P C R 方法擴(kuò)增出特異性目的條帶。P C R 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化D H 5a 大腸桿菌克隆至p M D l 8 - T 載體上，經(jīng)

4、藍(lán)白斑和氨芐青霉素抗性篩選、P C R 和雙酶切法鑒定，分別獲得了重組質(zhì)粒p T - S 1 0 和p T - S 1 l ，并進(jìn)行序列測(cè)定。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)編碼蛋白的理化性質(zhì)、跨膜區(qū)、功能域及蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后分別將目的基因轉(zhuǎn)入p G E X - 4 T - 1 載體，獲得原核表達(dá)載體p G E X ．S 1 0 和p G E X ，S 1 1 。將原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入B L 2 1s t a r ( D

5、E 3 ) E ．c o l i 中得到了高效表達(dá)，分別獲得了約5 9 k D 的P n s l 0 融合蛋白和4 6 k D 的P n s l l 融合蛋白。將獲得的兩個(gè)融合蛋白分別免疫大耳白兔制備了特異性抗血清，間接E L I S A法測(cè)定抗血清效價(jià)為1 ：2 0 4 8 和1 ：3 0 7 2 ，W e s t e r nb l o t 鑒定表明抗血清特異性強(qiáng)。表達(dá)產(chǎn)物及多克隆抗體的獲得為下階段深入研究提供了實(shí)驗(yàn)材料。關(guān)鍵詞：R