人膽囊癌SP細胞的分選、鑒定及TGF-β對其豐度的影響和機制的研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：在人膽囊癌細胞系GBC-SD中檢測、分選SP細胞亞群，并檢測該群細胞與干細胞相關的生物學特性。
　　 方法：采用熒光激活細胞分選技術（FACS）從人膽囊癌細胞系GBC-SD中檢測、分選人膽囊癌SP細胞、非SP細胞；利用Transwell 侵襲小室模型檢測SP、非SP細胞侵襲能力，通過MTT 方法檢測化療藥物對SP、非SP細胞生長抑制的影響；通過定量PCR檢測SP、非SP細胞ABC 家族中4 種轉運蛋

2、白（ABCA2，MDR1，MRP1和ABCG2）的表達；通過流式技術分析SP、非SP細胞與4 種干細胞標記物（CD24，CD34，CD44和CD133）的關系；利用體內、外成瘤實驗檢測兩種細胞亞群的成瘤特性，并通過FACS 檢測新鮮人膽囊癌組織中SP細胞的表達。
　　 結果:人膽囊癌細胞系GBC-SD中存在少量的SP細胞，約占總體細胞比例的0.87％；SP細胞較非SP細胞具有高的侵襲能力、耐藥特性，并高表達ABC 轉運蛋白；體內

3、、外實驗證明SP細胞具有強的致瘤能力，并可再生SP和非SP細胞，且再生的SP細胞的比例與分選前GBC-SD細胞中SP 比例相似；7例人膽囊癌組織中也包含著不同比例的SP細胞亞群。
　　 結論:人膽囊癌細胞系GBC-SD中SP細胞亞群具有類似干細胞的生物學特性。
　　 第二部分
　　 目的:檢測TGF-β誘導的EMT對人膽囊癌細胞系GBC-SD中SP細胞表達的影響，為下一步研究其機制奠定基礎。
　　 方法:

4、在體外培養(yǎng)的GBC-SD細胞中加入TGF-β后，相差倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化，通過RT-PCR、Western blotting 檢測E-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白水平表達；并通過MTT 檢測發(fā)生EMT的GBC-SD細胞對3 種化療藥物吉西他濱、米托蒽醌和表柔比星的敏感性；通過FACS和定量PCR分別檢測GBC-SD在TGF-β誘導下SP細胞比例的改變以及ABCG2 mRNA的表達。
　　 結果:T

5、GF-β可誘導GBC-SD細胞向間質型細胞形態(tài)轉化，間質標記蛋白VimentinmRNA和蛋白水平表達上調，上皮標記蛋白E-cadherin的mRNA和蛋白水平表達下調；且發(fā)生EMT后GBC-SD細胞對吉西他濱、米托蒽醌和表柔比星的IC50值分別增加倍8.1 倍、40 倍和5.7 倍。GBC-SD細胞在TGF-β處理下，SP細胞的豐度以及ABCG2 mRNA表達均明顯增加；撤除TGF-β誘導后，發(fā)生EMT轉化的GBC-SD細胞逐漸恢復至

6、上皮細胞表型。
　　 結論:TGF-β誘導的可逆性EMT 通過上調ABCG2 依賴的SP細胞增加了GBC-SD細胞的耐藥性，促進腫瘤細胞的干性轉化。
　　 第三部分
　　 目的:初步闡明Smad3在TGF-β誘導GBC-SD細胞發(fā)生EMT 上調SP細胞豐度過程中的功能。
　　 方法:合成以Smad3基因為靶點的siRNA，并將其轉染至經TGF-β誘導發(fā)生EMT的GBC-SD細胞。Western blott

7、ing 檢測Smad3-siRNA 轉染前、后發(fā)生EMT的GBC-SD細胞中Smad3和E-cadherin 蛋白的表達水平，并通過FACS 檢測SP細胞亞群的表達比例。
　　 結果:在TGF-β的誘導下，GBC-SD細胞中Smad3 蛋白發(fā)生磷酸化；Smad3-RNAi轉染至GBC-SD細胞后，Smad3 蛋白表達降低；在TGF-β和siRNA 聯(lián)合作用下，SP細胞的豐度相對于無RNAi 干擾組下調，而E-cadherin 蛋