A2AR在小鼠狼瘡腎炎中的作用研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種慢性自身免疫性疾病,可累及全身多個系統(tǒng)。狼瘡腎炎(lupus nephritis,LN)是SLE最常見的并發(fā)癥,臨床可表現(xiàn)為慢性腎炎綜合征、腎病綜合征甚至急進(jìn)性腎炎,病理類型多樣,病程呈慢性緩解和急性發(fā)作交替的特點,直接影響其預(yù)后。免疫炎癥反應(yīng)是LN進(jìn)展的主要機(jī)制之一。
　　 腺苷是在缺氧、缺血和炎癥時由組織局部產(chǎn)生,傳統(tǒng)作用是調(diào)節(jié)組織血流。

2、大量研究表明,腺苷是一種重要的內(nèi)源性抗炎和免疫抑制分子,其作用主要是通過與G蛋白偶聯(lián)的腺苷受體(Adenosine receptors,ARs)介導(dǎo)。目前已發(fā)現(xiàn)腺苷受體有四種亞型,并已被成功克隆,分別為A1,A2A,A2B和A3腺苷受體。四種腺苷受體亞型均表達(dá)于免疫細(xì)胞表面,并參與先天性和獲得性免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。最新研究表明激活A(yù)2A亞型腺苷受體(A2AR)能抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng),包括減少中性粒細(xì)胞氧代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、抑制單個核細(xì)胞促炎因子(如

3、TNF-α、IL-6和IL-12)的釋放、抑制T細(xì)胞的活化和功能。
　　 A2AR mRNA不僅表達(dá)于免疫細(xì)胞,還表達(dá)于正常大鼠腎臟固有細(xì)胞如腎乳頭和外髓降小管直部。在鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的大鼠糖尿病腎病腎皮質(zhì)中A2ARmRNA和蛋白表達(dá)增加。激活A(yù)2AR可減輕T細(xì)胞介導(dǎo)的小鼠腸炎,抑制促炎因子的表達(dá),抑制MLR—T細(xì)胞增生和小鼠皮膚移植排斥反應(yīng),抑制新月體腎炎巨噬細(xì)胞的激活。然而,A2AR在LN中的作用尚不清楚。因此,本研

4、究探討:①A2AR在小鼠狼瘡腎炎模型腎臟的表達(dá)；②選擇性激活A(yù)2AR對小鼠狼瘡腎炎模型蛋白尿、腎功能、腎臟病理損害及腎臟炎癥細(xì)胞浸潤的影響；③選擇性激活A(yù)2AR對小鼠狼瘡腎炎模型脾細(xì)胞增殖和活化的影響。
　　 第一章MRL/lpr小鼠狼瘡腎炎A2AR的表達(dá)
　　 一、材料和方法
　　 1.小鼠狼瘡腎炎模型
　　 MRL/lpr小鼠在12周齡時已有明顯腎損害,取9只雌性MRL/lpr小鼠作為模型組,以8只1

5、2周齡雌性MRL/MP小鼠作為正常對照組。代謝籠留取24小時尿,測尿蛋白肌酐比值及24小時尿蛋白定量。麻醉后心臟穿刺取血分離血清檢測血肌酐,血尿素氮及抗dsDNA抗體。留取腎臟、唾液腺、脾臟,同時稱脾臟和淋巴結(jié)總重量。部分組織以10％中性福爾馬林溶液固定,石蠟包埋,腎組織石蠟切片行常規(guī)病理染色和免疫組化染色。部分腎組織以O(shè)CT包埋,冰凍切片行免疫組化及免疫熒光檢測,其余液氮冷凍,-80℃保存,用于RT-PCR、Western Blot檢

6、測。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 大鼠腎小管上皮細(xì)胞株NRK-52E(n=3)及人腎小管上皮細(xì)胞株HK-2(n=3),用含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37℃,5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱,每2～3天換液一次。細(xì)胞融合約90％～100％時收集蛋白。
　　 3.淋巴結(jié)及脾腫大的評價
　　 處死動物后,稱量每只動物淋巴結(jié)(頸部、支氣管)及脾臟的重量,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
　　 4.組

7、織學(xué)損傷評估
　　 腎組織、唾液腺石蠟切片行HE、PAS染色,觀察腎小球、腎小管、腎血管及唾液腺病理損害情況。腎小球損害程度按0-3分的半定量計分方法評價:正常腎小球,為0分；系膜細(xì)胞增殖和(或)細(xì)胞浸潤,為輕度記為1分；系膜細(xì)胞增殖和(或)細(xì)胞浸潤基礎(chǔ)上伴系膜插入和(或)內(nèi)皮細(xì)胞增生,為中度記為2分；中度損傷基礎(chǔ)上伴有新月體形成為重度記為3分。每只動物至少評價40個連續(xù)非重疊的腎小球(×400),最終評分由所有高倍鏡下腎小球計

8、分的平均值得出。腎小管間質(zhì)損傷定義為近端小管刷狀緣消失、腎小管擴(kuò)張、萎縮以及管型形成。腎小管損害程度按0-4分的半定量計分方法評價:正常腎小管,為0分；損害腎小管數(shù)占總腎小管數(shù)<25％,為1分；25％-50％,為2分；51％-75％,為3分；>75％,為4分。每只動物至少評價30個連續(xù)非重疊的高倍鏡下視野(×400),最終評分由所有高倍鏡下視野計分的平均值得出。腎血管損害程度按0—3分的半定量方法評價:正常血管,為0分:血管周圍細(xì)胞浸潤

9、,為輕度記為1分；有動脈壁的破壞,為中度記為2分；有肌層和內(nèi)膜的增厚,為重度記為3分。對每只動物的所有血管進(jìn)行評價,最終評分由所有計分的平均值得出。頜下腺炎癥程度按0-3分的半定量方法評價:正常,為0分；細(xì)胞浸潤局限于血管和(或)導(dǎo)管周圍,為輕度記為1分:腺體實質(zhì)也有細(xì)胞浸潤,為中度記為2分；有纖維化和(或)肉芽腫形成,為重度記為3分。對每只動物頜下腺的所有導(dǎo)管及血管進(jìn)行評價,最終評分由所有導(dǎo)管及血管評分的平均值得出,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤

10、表示。
　　 5.免疫組織化學(xué)及免疫熒光染色和量化
　　 腎組織石蠟切片用大鼠抗.人CD3抗體(與小鼠T細(xì)胞有交叉反應(yīng),識別小鼠T細(xì)胞)和抗小鼠A2AR抗體行免疫組織化學(xué)染色。冰凍切片用大鼠抗-小鼠CD68抗體(識別小鼠巨噬細(xì)胞)免疫組化染色。分別計算20個連續(xù)非重疊腎小球、20個腎間質(zhì)及5個血管周圍高倍鏡視野下(×400)CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)和CD3+T細(xì)胞數(shù)。冰凍切片分別用FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG和抗小鼠C3抗體免

11、疫熒光染色。IgG和C3免疫熒光染色按0-3分半定量評分進(jìn)行評價:無沉積記為0分,輕度沉積記為1分,中度沉積記為2分,重度沉積記為3分。每只動物至少評價25個連續(xù)非重疊腎小球,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。
　　 6.RT-PCR
　　 提取腎組織總RNA,RT-PCR檢測MHCⅡ、MCP—1、IFN-γ和A2AR mRNA,以GAPDH為內(nèi)參照,計算與內(nèi)參照比值。
　　 7.Western Blot
　　 提

12、取腎組織及各腎小管上皮細(xì)胞株蛋白,Western Blot檢測A2AR,以GAPDH為內(nèi)參照,計算與內(nèi)參照比值。
　　 8.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 均數(shù)比較采用方差分析(ANOVA),p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 二、結(jié)果
　　 1.蛋白尿
　　 MRL/Ipr小鼠在12周齡開始出現(xiàn)蛋白尿,正常對照組只有少量尿蛋白排泄,模型組和正常對照組相比尿蛋白定量顯著增多。24小時尿蛋白分別為(1.51±

13、0.41)mg/24h vs(0.41±0.06)mg/24h；蛋白肌酐比分別為(5.62±0.7)mg/mg vs(0.27±0.04)mg/mg。P值均小于0.01。
　　 2.血生化
　　 MRL/Ipr狼瘡小鼠模型血清尿素氮(BUN)及肌酐(Cr)水平與正常對照組相比,均有顯著升高。BUN分別為(8.19±0.58)mmol/L vs(5.86±0.47)mmol/L。Cr分別為(12.44±1.01)μmol/

14、L vs(10.51±1.2)μmol/L。正常對照組未檢測到抗dsDNA抗體。MRL/Ipr狼瘡小鼠模型血清抗dsDNA抗體明顯升高(53.34±21.2)μg/ml。p值均小于0.01。
　　 3.脾臟和淋巴結(jié)重量
　　 MRL/Ipr狼瘡小鼠模型組脾臟和淋巴結(jié)增生腫大明顯,其重量顯著高于正常對照組,分別為(135.7±12.1)mg vs(91.0±13.0)mg和(89.3±17.8)mg vs(17.6±8.0

15、)mg。p值均小于0.01。
　　 4.腎臟組織學(xué)
　　 MRL/Ipr狼瘡小鼠模型的組織學(xué)改變包括腎小球細(xì)胞增生和(或)浸潤、腎小管間質(zhì)損傷、血管損傷及唾液腺炎癥。模型組和正常對照組腎小球評分分別為(1.03±0.04)vs(0.01±0.003),腎小管間質(zhì)評分分別為(0.14±0.02)vs(0.01±0.001),腎血管評分分別為(0.46±0.1)vs(0.003±0.006),唾液腺炎癥評分分別為(0.46±

16、0.06)vs(0.01±0.001)。p值均小于0.01。
　　 5.腎臟炎癥細(xì)胞浸潤
　　 免疫組化染色顯示在正常對照組小鼠腎間質(zhì)偶爾見個別巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤,腎小球內(nèi)極少見巨噬細(xì)胞浸潤,腎血管周圍偶爾見個別巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤。而在小鼠狼瘡腎炎模型中,腎間質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤明顯增多,腎血管周圍巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤顯著增多,但腎小球內(nèi)僅檢測到少量巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞。
　　 模型組和正常對照組腎小球巨噬細(xì)

17、胞浸潤數(shù)分別為(0.6±0.04)細(xì)胞/gcs(腎小球橫切面,gcs)vs(0.03±0.03)細(xì)胞/ges;腎小管間質(zhì)為(8.4±0.26)細(xì)胞/hpfva(0.3±0.05)細(xì)胞/hpf;血管周圍為(20.9±0.96)細(xì)胞/血管 vs(0.3±0.1)細(xì)胞/血管。p值均小于0.01。
　　 模型組和正常對照組腎小球T細(xì)胞浸潤數(shù)分別為(0.06±0.02)細(xì)胞/gcs vs(0.01±0.02)細(xì)胞/gcs；腎小管間質(zhì)為(1

18、.8±0.2)細(xì)胞/hpf vs(0.1±0.04)細(xì)胞/hpf;血管周圍為(9.0±3.6)細(xì)胞/血管vs(0.24±0.07)細(xì)胞/血管。p值均小于0.01。
　　 6.腎臟IgG和C3沉積
　　 免疫熒光染色顯示,小鼠狼瘡腎炎模型腎組織中有大量的IgG和C3呈顆粒狀沉積于腎小球毛細(xì)血管壁、系膜區(qū)；腎小管間質(zhì)及小動脈壁也有不同程度沉積。模型組和正常對照組腎臟IgG熒光強(qiáng)度評分分別為(0.97±0.18)vs(0.01

19、±0.02)；C3分別為(0.64±0.1)vs(0.01±0.01)。p值均小于0.01。
　　 7.腎臟MHCⅡ、MCP-1和IFN-γ mRNA表達(dá)
　　 RT-PCR結(jié)果顯示,狼瘡小鼠腎臟MHCⅡ、MCP-1和IFN-γmRNA表達(dá)與正常對照組相比明顯增高,分別為(0.47±0.12)vs(0.05±0.02)；(0.23±0.05)vs(0.09±0.03)和(0.15±0.04)vs(0.02±0.01)。p

20、值均小于0.01。
　　 8.腎臟A2AR的表達(dá)
　　 RT-PCR顯示,狼瘡腎炎小鼠腎臟A2AR mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)(0.45±0.28)vs(0.18±0.09)；Western blot結(jié)果顯示,狼瘡腎炎小鼠腎臟A2AR蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)(2.63±0.71)vs(0.50±0.18)。p值均小于0.01。免疫組化顯示,正常對照組小鼠腎臟未檢測到A2AR的表達(dá),而狼瘡腎炎小鼠A2AR染色陽性細(xì)胞主要位于腎小球上

21、皮細(xì)胞、毛細(xì)血管袢、腎小管上皮細(xì)胞以及腎間質(zhì)細(xì)胞中。
　　 9.腎小管上皮細(xì)胞株A2AR的表達(dá)
　　 Western blot結(jié)果顯示,在HK-2及NRK-52E這兩種腎小管上皮細(xì)胞株均表達(dá)A2AR蛋白
　　 三、小結(jié)
　　 1.MRL/lpr小鼠于12周齡出現(xiàn)腎臟損害,表現(xiàn)為蛋白尿、血肌酐升高,腎臟病理表現(xiàn)為腎小球細(xì)胞增生、免疫復(fù)合物沉積、腎間質(zhì)損害和腎小血管炎；
　　 2.MRL/lpr小鼠腎

22、臟MHCⅡ、MCP-1和IFN-γ mRNA表達(dá)增加,伴有顯著T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤；
　　 3.MRL/lpr小鼠腎臟A2AR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào),A2AR表達(dá)于腎小球上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管袢、腎小管上皮細(xì)胞以及腎間質(zhì)細(xì)胞中。
　　 4.腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2及NRK-52E)表達(dá)A2AR蛋白。
　　 第二章CGS21680對MRL/lpr小鼠狼瘡腎炎的影響
　　 一、材料和方法
　　 1.

23、小鼠狼瘡腎炎治療
　　 12周齡的雌性MRL/lpr小鼠共16只,分為治療組和模型對照組,各8只小鼠。治療組小鼠每日腹腔注射選擇性A2AR激動劑CGS21680(0.4mg/kg/d),治療8周,模型對照組僅給予等量溶媒腹腔注射。治療過程中每2周用代謝籠留取24小時尿,測尿蛋白肌酐比值及24小時尿蛋白定量。20周時麻醉后心臟穿刺取血分離血清檢測血肌酐,血尿素氮及抗dsDNA抗體。留取腎臟、唾液腺、脾臟,同時稱脾臟和淋巴結(jié)總重量。

24、部分組織以10％中性福爾馬林溶液固定石蠟包埋,腎組織石蠟切片行常規(guī)病理染色和免疫組化染色。部分腎組織以O(shè)CT包埋,冰凍切片行免疫組化和免疫熒光檢測,其余液氮冷凍,-80℃保存,用于RT-PCR、Western Blot檢測。20周齡雌性MRL/MP小鼠作為正常對照組。
　　 2.淋巴結(jié)病變及脾臟腫大的評價
　　 處死動物后,稱量每只動物淋巴結(jié)(頸部、支氣管)及脾臟的重量,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
　　 3.組織學(xué)

25、損傷評估
　　 腎組織石蠟切片行HE、PAS染色,觀察腎小球、腎小管、腎血管及唾液腺病理損害情況,具體評分方法同第一章。
　　 4.免疫組織化學(xué)及免疫熒光染色和量化
　　 腎組織石蠟切片用大鼠抗-人CD3抗體(與小鼠T細(xì)胞有交叉反應(yīng),識別小鼠T細(xì)胞),抗小鼠I-AK單克隆抗體(識別小鼠MHCⅡ陽性細(xì)胞。冰凍切片分別用大鼠抗.小鼠CD68抗體(識別小鼠巨噬細(xì)胞)免疫組化染色,FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG和抗小鼠C3抗

26、體免疫熒光染色,具體評分方法同第一章。
　　 5.RT-PCR
　　 提取腎組織總RNA,RT-PCR檢測MHCⅡ、MCP-1、IFN-γ和A2AR mRNA,以GAPDH為內(nèi)參照,計算與內(nèi)參照比值。
　　 6.Western Blot
　　 提取腎組織蛋白,Western Blot檢測A2AR,以GAPDH為內(nèi)參照,計算與內(nèi)參照比值。
　　 7.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 均數(shù)比較采用方差分析(A

27、NOVA),p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 二、結(jié)果
　　 1.CGS21680對狼瘡小鼠蛋白尿的影響
　　 CGS21680治療8周后,治療組尿蛋白顯著低于模型對照組。20周時治療組和模型對照組24小時尿蛋白分別為(1.76±0.32)mg/24h vs(2.79±0.53)mg/24h；尿蛋白肌酐比分別為(5.13±1.63)mg/mg vs(7.93±1.40)mg/mg。P值均小于0.05。

28、>　　 2.CGS21680對狼瘡小鼠血生化的影響
　　 CGS21680治療8周后,治療組小鼠腎功能顯著改善。治療組血尿素氮水平明顯下降,治療組和模型對照組分別為(9.4±0.3)mmol/L vs(12.7±2.6)mmol/L:血清肌酐水平亦明顯下降,治療組和模型對照組分別為(16.2±0.9)μmol/L vs(24.0±3.0)μmol/L。P值均小于0.01。
　　 3.CGS21680對狼瘡小鼠血清抗ds

29、DNA抗體的影響
　　 CGS21680治療8周后,CGS21680治療組血清抗dsDNA抗體水平與狼瘡腎炎模型組相比顯著下降,為(142.8±44.7)μg/ml vs(397.2±86.2)μg/ml,P<0.01。
　　 4.CGS21680對狼瘡小鼠脾臟和淋巴結(jié)重量的影響
　　 CGS21680治療8周后,脾臟和淋巴結(jié)重量絕對值有所下降,但無統(tǒng)計學(xué)差異。分別為(251±133)mg vs(378±198)

30、mg,p>0.05:(134±42)mg vs(183±64)mg,p>0.05。
　　 5.CGS21680對狼瘡小鼠組織學(xué)的影響
　　 CGS21680治療8周后,治療組腎小球損傷評分、腎小管間質(zhì)損傷評分、腎血管炎癥評分及唾液腺炎癥評分明顯下降,與模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異。治療組和對照組腎小球評分分別為(1.33±0.10)vs(1.97±0.1),腎小管間質(zhì)評分分別為(0.25±0.05)vs(0.93±0.19

31、)；腎血管評分分別為(0.60±0.18)vs(1.30±0.32)；唾液腺炎癥評分分別為(0.64±0.16)vs(0.96±0.18)。p值均小于0.01。
　　 6.CGS21680對狼瘡小鼠腎臟炎癥細(xì)胞浸潤的影響
　　 CGS21680治療8周后,腎小球、腎小管間質(zhì)及血管周圍巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的浸潤較狼瘡腎炎模型組均明顯減少。
　　 治療組和模型對照組腎小球巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)分別為(0.8±0.1)細(xì)胞/gcs

32、 vs(2.6±0.3)細(xì)胞/gcs；腎小管間質(zhì)分別為(10.5±1.6)細(xì)胞/hpf vs(39.1±5.1)細(xì)胞/hpf；血管周圍分別為(36.1±4.4)細(xì)胞/血管 vs(257.6±56.1)細(xì)胞/血管。p值均小于0.01。
　　 治療組和模型對照組腎小球T細(xì)胞浸潤數(shù)分別為(0.1±0.09)細(xì)胞/gcs vs(0.7±0.2)細(xì)胞/gcs；腎小管間質(zhì)分別為(2.2±0.8)細(xì)胞/hpf vs(7.5±2.3)細(xì)胞/hp

33、f；血管周圍分別為(23.4±3.7)細(xì)胞/血管 vs(83.1±15.8)細(xì)胞/血管。p值均小于0.01。
　　 7.CGS21680對狼瘡小鼠腎臟IgG和C3沉積的影響
　　 CGS21680治療后,狼瘡小鼠腎臟IgG和C3沉積明顯減少。治療組和模型對照組腎臟IgG熒光評分分別為(0.80±0.12)vs(2.88±0.24),C3分別為(0.65±0.15)vs(2.24±0.09)。p值均小于0.01。
　

34、　 8.CGS21680對狼瘡小鼠MHCⅡ表達(dá)的影響
　　 免疫組化染色顯示,CGS21680治療后狼瘡小鼠腎臟MHCⅡ染色陽性細(xì)胞顯著減少；RT-PCR結(jié)果顯示,CGS21680治療后狼瘡小鼠腎臟MHCⅡmRNA表達(dá)顯著降低(0.08±0.03)vs(0.44±0.09),p<0.01,與免疫組化結(jié)果一致。
　　 9.CGS21680對狼瘡小鼠IFN-γ和MCP-1mRNA的影響
　　 RT-PCR結(jié)果顯示,

35、CGS21680治療后狼瘡小鼠腎臟IFN-γ和MCP-1轉(zhuǎn)錄水平與模型對照組相比降低了59％和58％。p值均小于0.01。
　　 10.CGS21680對狼瘡小鼠腎臟A2AR表達(dá)的影響
　　 CGS21680對狼瘡小鼠腎臟A2AR的表達(dá)并無影響。治療組和模型對照組A2AR mRNA和蛋白水平無明顯差異,p>0.05。
　　 三、小結(jié)本研究發(fā)現(xiàn)在MRL/lpr狼瘡小鼠中,使用CGS21680選擇性激活A(yù)2AR:

36、r>　　 1.減少MRL/lpr狼瘡小鼠尿蛋白的排泄,改善腎功能；
　　 2.減輕腎小球、腎小管間質(zhì)及腎血管損害；
　　 3.抑制腎臟炎癥細(xì)胞浸潤；
　　 4.減少腎臟IgG和C3沉積；
　　 5.抑制腎臟MCP-1、IFN-γ及MHCⅡmRNA的表達(dá)；
　　 6.降低血清抗dsDNA抗體水平。
　　 第三章CGS21680對MRL/lpr小鼠脾細(xì)胞增殖活化的影響
　　 一、材料

37、和方法
　　 1.脾細(xì)胞分離及分組
　　 分離MRL/Ipr小鼠脾細(xì)胞,分為:PBS組、LPS1.0μg/ml組、LPS1.0μg/ml+CGS2168010μM組(LC組),培養(yǎng)12h和24h,收樣本分別提取總RNA、核蛋白及上清液。
　　 2.RT-PCR
　　 提取脾細(xì)胞總RNA,RT-PCR檢測MHCⅡ、MCP-1和IFN-γmRNA,以GAPDH為內(nèi)參照,計算與內(nèi)參照比值。
　　 3.W

38、estern Blot
　　 提取脾細(xì)胞核蛋白,Western Blot檢測NF-κB p65,以Fibrillarin為內(nèi)參照,計算與內(nèi)參照比值。
　　 4.MTT
　　 分離MRL/lpr小鼠脾細(xì)胞,按上述分組培養(yǎng)24 h,MTT檢測細(xì)胞增殖。
　　 5.ELISA
　　 分離MRL/lpr小鼠脾細(xì)胞,按上述分組培養(yǎng)24 h,ELISA檢測細(xì)胞上清IFN-γ水平。
　　 6.統(tǒng)計學(xué)分析

39、
　　 均數(shù)比較采用方差分析(ANOVA),p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 二、結(jié)果
　　 1.CGS21680對MRL/lpr小鼠脾細(xì)胞增殖的影響
　　 與PBS相比,LPS刺激后脾細(xì)胞增殖顯著增加；與LPS組相比CGS21680處理后,LC組LPS誘導(dǎo)的增殖顯著降低(0.46±0.03)vs(0.93±0.08),p<0.01。
　　 2.CGS21680對MRL/lpr小鼠脾細(xì)胞IF

40、N-γ、MCP-1和MHC-ⅡmRNA的影響
　　 與PBS組相比,LPS刺激后脾細(xì)胞IFN-γ、MCP—1和MHC—Ⅱ mRNA表達(dá)顯著增加；與LPS組相比CGS21680處理后,LC組IFN-γ、MCP-1和MHC-ⅡmRNA表達(dá)降低了50％,52％和50％,p<0.01。
　　 3.CGS21680激活A(yù)2AR對MRL/lpr小鼠脾細(xì)胞NF-κB活化的影響
　　 與PBS組相比,LPS刺激后脾細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)N

41、F-κBp65顯著增加；與LPS組相比CGS21680處理后,LC組脾細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65顯著降低,p<0.01。
　　 4.CGS21680對MRL/lpr狼瘡小鼠脾細(xì)胞IFN-γ分泌的影響
　　 與PBS組相比,LPS刺激后脾細(xì)胞分泌IFN-γ顯著增加；與LPS組相比CGS21680處理后,LPS誘導(dǎo)的脾細(xì)胞IFN-γ分泌顯著降低(454.8±89.4)pg/ml vs(569.8±76.1)pg/ml,p<0.

42、05。
　　 三、小結(jié)
　　 1.LPS刺激誘導(dǎo)MRL/lpr小鼠脾細(xì)胞增殖,活化NF-κB,上調(diào)MCP-1、IFN-γ及MHCⅡ分子的表達(dá),增加IFN-γ分泌；
　　 2.激活A(yù)2AR抑制MRL/lpr小鼠脾細(xì)胞增殖,抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的活化,顯著下調(diào)MCP—1、IFN-γ及MHCⅡ分子表達(dá),降低IFN-γ分泌。
　　 全文總結(jié)
　　 本研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)選擇性激活A(yù)2AR可抑制MRL

43、/lpr小鼠腎臟MHCⅡ分子的表達(dá),抑制腎臟趨化因子MCP-1及促炎癥細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá),降低血中自身抗體水平,減少腎臟炎癥細(xì)胞浸潤及免疫復(fù)合物沉積,減輕腎臟病理和功能損害,表明A2AR在MRL/lpr小鼠狼瘡腎炎的致病中發(fā)揮重要作用。體外研究表明激活A(yù)2AR能抑制LPS誘導(dǎo)的MRL/lpr狼瘡小鼠脾細(xì)胞增殖和NF-κB信號通路的活化,減少IFN-γ的分泌,下調(diào)MCP-1、IFN—γ及MHCⅡ分子表達(dá)而發(fā)揮抗炎效應(yīng)。