新型Eg5靶向抑制劑S-(methoxytrity1)-L-cysteine治療前列腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 前列腺癌(prostate cancer)是世界范圍內(nèi)男性的第二大惡性腫瘤，2008年全世界大約有903，500例新發(fā)前列腺癌病人。在歐美等西方國(guó)家，前列腺癌是男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，同時(shí)也是致死性第二位的惡性腫瘤，2009年美國(guó)大約有27，360人死于去勢(shì)抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC）。亞洲國(guó)家前列腺癌的發(fā)病率和死亡率低于西方國(guó)家，但近年來(lái)隨

2、著生活習(xí)慣的改變及人口老齡化增加，前列腺癌在中國(guó)等亞洲國(guó)家呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。目前我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率僅低于膀胱癌和腎癌，已居泌尿系惡性腫瘤的第三位，并且發(fā)病年齡也日趨年輕化，前列腺癌已經(jīng)成為臨床上老年男性常見(jiàn)惡性腫瘤之一。
　　 自從1941年，Huggins創(chuàng)立了雄激素剝奪療法(androgen deprivation therapy，ADT)，現(xiàn)在包括手術(shù)去勢(shì)和LHRH類(lèi)似物的藥物去勢(shì)為主的雄激素剝奪療法，已成為對(duì)于外科手

3、術(shù)或放射治療不能奏效的進(jìn)展期前列腺癌病人的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。一般來(lái)說(shuō)，這些病人最初1-2年內(nèi)對(duì)雄激素剝奪療法有效，但是隨后絕大部分進(jìn)展為CRPC。2004年，發(fā)表在新英格蘭雜志的SWOG9916和TAX327兩項(xiàng)研究證實(shí)了以多西紫杉醇(docetaxel)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療在治療CRPC中的重要作用。基于以上兩項(xiàng)研究的成果，F(xiàn)DA批準(zhǔn)以多西紫杉醇為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療為CRPC的一線(xiàn)治療，這一方案現(xiàn)已成為臨床上CRPC的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。
　　

4、 但是，當(dāng)CRPC患者病情繼續(xù)進(jìn)展，臨床上尚無(wú)有效的標(biāo)準(zhǔn)治療方案或者處理共識(shí)。并且多西紫杉醇等抗微管類(lèi)的藥物，由于同時(shí)作用于有絲分裂期和間期的微管，抗癌的選擇性較差，會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成損害而出現(xiàn)神經(jīng)病變等神經(jīng)毒性副作用，容易引起β-微管蛋白上藥物結(jié)合位點(diǎn)的變異及P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和β-微管蛋白的過(guò)表達(dá)而產(chǎn)生相應(yīng)的副作用，并能引起多重耐藥性(multidrug resistance，MDR);這些都限制了抗

5、微管藥物的臨床療效和應(yīng)用。多西紫杉醇耐藥性CRPC患者平均生存期通常低于1年。因此，急切需要我們發(fā)展新的替代治療策略，以延長(zhǎng)患者的生存期和提高患者的生存質(zhì)量。
　　 腫瘤細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期后，其有絲分裂不受調(diào)控，導(dǎo)致不斷的生長(zhǎng)增殖?，F(xiàn)在臨床廣泛應(yīng)用的多西紫杉醇等抗微管類(lèi)細(xì)胞毒性藥物正是對(duì)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行干擾從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Eg5，又被稱(chēng)作紡錘體驅(qū)動(dòng)蛋白，在細(xì)胞有絲分裂早期對(duì)雙極紡錘體的形成和復(fù)制染色體的分離起著至關(guān)重要的作

6、用，表達(dá)于增殖的組織細(xì)胞中，已成為一個(gè)極具吸引力腫瘤化療靶點(diǎn)。
　　 研究表明，Eg5蛋白高表達(dá)于惡性增殖的組織細(xì)胞中，但在穩(wěn)定成熟分化的組織細(xì)胞如機(jī)體的神經(jīng)細(xì)胞中未見(jiàn)其表達(dá)。研究證實(shí)，Eg5蛋白作為新的抗有絲分裂藥物的靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤化療時(shí)，對(duì)機(jī)體正常組織無(wú)影響，臨床應(yīng)用副作用少，無(wú)抗微管藥物類(lèi)似的神經(jīng)毒性副作用。
　　 1999年Science報(bào)道了第一個(gè)小分子Eg5蛋白抑制劑monastrol，由于其能誘導(dǎo)單星樣紡錘體

7、（monoastral spindle）的形成而得名，該藥能特異性的結(jié)合Eg5蛋白并抑制其功能，誘導(dǎo)增殖的腫瘤細(xì)胞停滯在有絲分裂期，并促使細(xì)胞凋亡。Eg5蛋白抑制劑不作用于微管，不能被P-糖蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，可克服由于P-糖蛋白過(guò)表達(dá)而引起的多重耐藥性，故對(duì)紫杉烷類(lèi)耐藥的腫瘤也能起到有效的治療效果。鑒于monastrol的有效的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，大量小分子Eg5抑制劑被相繼研究開(kāi)發(fā)出來(lái)。
　　 STLC(S-trityl-L-

8、cystein)是DimitriosA等于2004年首先發(fā)現(xiàn)證實(shí)的有效的小分子Eg5蛋白抑制劑，與monastrol具有相同Eg5結(jié)合位點(diǎn)，與Eg5結(jié)合更加緊密、特異性更高，抗細(xì)胞增殖的能力比monastrol提高了約36倍。日本京都大學(xué)對(duì)STLC進(jìn)行化學(xué)修飾后，首先發(fā)現(xiàn)報(bào)道了S(MeO)TLC(S-(methoxytrityl)-L-cysteine)，一種強(qiáng)有力的細(xì)胞滲透性小分子Eg5蛋白抑制劑，在測(cè)試的STLC衍生物中抗細(xì)胞增殖的

9、能力最強(qiáng)。S(MeO)TLC能特異性的與Eg5蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)單極紡錘體的形成，其抑制細(xì)胞增殖的能力比STLC提高了10倍。最近京都大學(xué)藥學(xué)部又研制了KPYC10665(2-(trifluoromethyl)-9H-carbazole),KPYC10666(2-(tert-butyl)-9H-carbazole）和KPYC10728(7-(trifluoromethyl)-9H-pyrido[3，4-b]indole)等多種聯(lián)芳類(lèi)有效的E

10、g5抑制劑。
　　 我們的前期研究已經(jīng)報(bào)道了S(MeO)TLC作為新型的Eg5蛋白靶向抑制劑，在膀胱癌、腎癌中表現(xiàn)出強(qiáng)有力的抗癌效能，并且相比以往報(bào)道的大量Eg5抑制劑，有效給藥濃度更低、療效更好、安全性和靶向特異性更高。目前尚沒(méi)有研究系統(tǒng)的探討臨床前列腺癌標(biāo)本及前列腺癌細(xì)胞株中Eg5蛋白的表達(dá)，也沒(méi)有關(guān)于Eg5抑制劑特別是S(MeO)TLC對(duì)前列癌的體內(nèi)外治療效果及機(jī)制的系統(tǒng)研究。所以，我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，從而為前列癌的臨床診斷

11、及靶向治療提供有效的新型方法。
　　 目的：
　　 檢測(cè)前列腺癌臨床標(biāo)本及前列腺癌細(xì)胞中Eg5蛋白的表達(dá)水平，以探討Eg5蛋白是否可以作為前列腺癌治療的有效靶點(diǎn)，并探討S(MeO)TLC這種新型的Eg5抑制劑對(duì)前列腺癌的體內(nèi)外抗癌效能及機(jī)制。
　　 方法：
　　 (1)分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)由80例臨床局限性前列腺癌標(biāo)本構(gòu)建的組織芯片(tissuemicroarray，TMA)和用Wester

12、nBlot免疫蛋白印跡方法檢測(cè)人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3，DU145和LNCaP中Eg5的表達(dá)，分析探討Eg5蛋白是否可以作為前列腺癌治療的有效靶點(diǎn)。
　　 (2)體外實(shí)驗(yàn):采用MTT和臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)KPYC10665、KPYC10666、KPYC10728、STLC和S(MeO)TLC這5種Eg5抑制劑對(duì)前列腺癌細(xì)胞的抗增殖作用，計(jì)算出藥物的半數(shù)抑制濃度(50％inhibitingconcentration，IC50

13、);并通過(guò)Hoechst細(xì)胞核染色細(xì)胞凋亡檢測(cè)法，流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分布檢測(cè)法和免疫熒光法進(jìn)一步探討S(MeO)TLC抗前列腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞體外凋亡的效果和機(jī)制;最后采用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)S(MeO)TLC誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡中Caspase途徑相關(guān)蛋白表達(dá)，探討S(MeO)TLC誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的分子通路機(jī)制。
　　 (3)體內(nèi)試驗(yàn):構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3Luc，然后評(píng)估S(MeO)T

14、LC對(duì)PC3Luc皮下移植腫瘤模型的治療效果;并用H&E染色的方法檢測(cè)皮下種植腫瘤標(biāo)本的情況，進(jìn)一步探討S(MeO)TLC體內(nèi)抑制腫瘤增殖的機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 (1)PC3，DU145和LNCaP三種前列腺細(xì)胞中均檢測(cè)到了Eg5表達(dá)。超過(guò)一半(44/80)的臨床前列腺癌標(biāo)本中也檢測(cè)到了Eg5表達(dá)，并且前列腺臨床標(biāo)本中Eg5表達(dá)與Ki67標(biāo)記指數(shù)(ki67labelingindex)成顯著相關(guān)(P=0.004)。<

15、br>　　 (2)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明S(MeO)TLC比其他4個(gè)測(cè)試的Eg5抑制劑表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗前列腺細(xì)胞增殖作用，通過(guò)誘導(dǎo)增殖細(xì)胞停滯在有絲分裂期并形成典型的單極紡錘體細(xì)胞，隨后同時(shí)激活內(nèi)源性和外源性Caspase依賴(lài)性凋亡途徑誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 (3)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明S(MeO)TLC對(duì)前列腺細(xì)胞皮下移植瘤模型顯著的抑制作用(P＜0.05)也是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)停滯在有絲分裂期而實(shí)現(xiàn)的。
　　 結(jié)論：
　　

16、 (1)臨床前列腺癌標(biāo)本和前列腺癌細(xì)胞均存在Eg5蛋白的表達(dá)，Eg5蛋白可作為新型靶向化療藥物的有效的治療靶點(diǎn)。
　　 (2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及皮下種植腫瘤實(shí)驗(yàn)均證實(shí)S(MeO)TLC作為新型Eg5蛋白靶向小分子抑制劑通過(guò)將前列腺癌細(xì)胞及異種種植腫瘤細(xì)胞有絲分裂期停滯而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞同時(shí)經(jīng)內(nèi)源性和外源性caspase依賴(lài)性途徑發(fā)生凋亡。
　　 (3)S(MeO)TLC可通過(guò)腹腔注射的方式給藥，且是安全可靠的，并且其

17、抑制體內(nèi)外前列腺腫瘤生長(zhǎng)的效果要顯著強(qiáng)于STLC等其他Eg5抑制劑。
　　 (4)S(MeO)TLC是一種對(duì)前列腺癌有效的、有前途的抗癌藥物。
　　 創(chuàng)新及意義：
　　 (1)國(guó)內(nèi)外首次分析了局限性前列腺癌臨床標(biāo)本中Eg5蛋白表達(dá)水平，為前列腺癌臨床診斷提供依據(jù)。
　　 (2)國(guó)內(nèi)外首次證實(shí)了Eg5蛋白可以作為前列腺癌治療新的有效靶點(diǎn)。
　　 (3)國(guó)內(nèi)外首次對(duì)新型Eg5抑制劑S(MeO)TLC治