氣候帶與蜂膠活性成分及抗齲齒活性的關(guān)聯(lián).pdf

1、蜂膠作為一種天然保健品原料，在醫(yī)學(xué)、食品和日化領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注，它具有抗菌、消炎、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、調(diào)節(jié)心血管等生物學(xué)活性，這些生物學(xué)活性與其復(fù)雜的活性成分有著密切的聯(lián)系。蜂膠的活性成分與其膠源植物和地理源有著密不可分的聯(lián)系，歐洲及中國蜂膠的膠源植物為楊樹屬，巴西蜂膠的膠源植物為酒神菊，委內(nèi)瑞拉蜂膠的膠源植物為克魯西屬，埃及、肯尼亞蜂膠的膠源植物為血桐屬等。在膠源植物相同的情況下，不同氣候因素會影響膠源植物的生長，進而影響蜂膠的活性成

2、分。中國蜂膠為楊樹型蜂膠，即其膠源植物以楊樹屬為主，但中國幅員遼闊，氣候復(fù)雜，包含暖溫帶、中溫帶、中亞熱帶、北亞熱帶、南亞熱帶等多個氣候帶，可能導(dǎo)致不同氣候帶蜂膠在活性成分上有著較大的差別。探究不同氣候帶蜂膠活性成分的差異及其與氣候帶的關(guān)聯(lián)，對于蜂膠的品質(zhì)評價、鑒偽、生產(chǎn)原料的采集指導(dǎo)有著積極的意義。本研究采用高效液相色譜（High performance liquid chromatography, HPLC）以及高效液相色譜-電噴霧

3、質(zhì)譜聯(lián)用法（High performance liquid chromatography-Electrospray Ionization-mass spectrometry/mass spectrometry, HPLC-ESI-MS/MS）對中國不同氣候帶蜂膠乙酸乙酯提取物（Ethyl acetate extraction of propolis, EaEP）中的活性成分進行分析。通過支持向量機（Support Vector Mach

4、ine, SVM）建立分類模型，發(fā)掘蜂膠活性成分與氣候帶之間的關(guān)聯(lián)。并探究中國不同氣候帶EaEP對變形鏈球菌（Streptococci mutans, S.mutans）生長的影響，分析不同氣候帶 EaEP抑菌活性與其活性成分之間的關(guān)聯(lián)，期望為篩選高抗齲齒活性蜂膠原料提供依據(jù)。研究內(nèi)容及實驗結(jié)果如下：
　　1.蜂膠中酚類物質(zhì)的提取與分析方法建立：蜂膠經(jīng)過石油醚脫脂后，用乙酸乙酯超聲輔助提取，真空濃縮后冷凍干燥得到EaEP凍干物。建

5、立了EaEP的HPLC分析方法：色譜柱Thermo Hypersil GOLD C18（250mm×4.6mm，5.0μm）色譜柱；流動相為乙腈-0.3％甲酸；梯度洗脫；流速1 mL/min；進樣量10μL；柱溫30℃；檢測波長為280 nm。并對該方法進行了方法學(xué)考察，精密度測試中，色譜峰保留時間和峰面積RSD均小于2%；穩(wěn)定性測試中，色譜峰保留時間的峰面積RSD均小于5%；9種黃酮及酚酸對照品的檢出限在0.8354~3.5246×1

6、0-4 mg/mL之間，加標(biāo)回收率在94.54%~104.22%之間，RSD小于2%，該HPLC方法準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。
　　2. EaEP中活性多酚成分的鑒定：采用HPLC-DAD-ESI-MS/MS對暖溫帶（以北京房山樣品為例）的EaEP進行分析，通過將各色譜峰對應(yīng)的分子離子和碎片離子信息、保留時間、紫外光譜特征與對照品和相關(guān)文獻進行比對，共鑒定出33種黃酮及酚酸類化合物，其中有11種酚酸及其酯類，6種黃酮，8種黃酮

7、醇，3種二氫黃酮，5種二氫黃酮醇。通過對7個氣候帶共76個EaEP的HPLC色譜峰進行分析，建立了不同氣候帶 EaEP的指紋圖譜，并鑒定出不同氣候帶蜂膠樣品含有的典型特征成分。暖溫帶EaEP的典型活性成分可能為P-香豆酸肉桂酯、短葉松素-3-O-丁酸酯；中溫帶的典型活性成分可能為咖啡酸肉桂酯、松屬素和槲皮素；中亞熱帶的典型活性成分可能為槲皮素和P-香豆酸肉桂酯、短葉松素-3-O-丁酸酯以及保留時間為32.5 min色譜峰對應(yīng)的物質(zhì)（共有

8、峰峰編號為24號）；南亞熱帶的典型活性成分可能為咖啡酸肉桂酯和7-甲氧基短葉松素-3-乙酸酯；北亞熱帶各地理源EaEP相應(yīng)色譜峰響應(yīng)值較為接近，說明北亞熱帶蜂膠的化學(xué)組成較為相似，存在著明顯的共性。
　　3.氣候帶與蜂膠活性成分之間的關(guān)聯(lián)：建立了基于EaEP活性成分，并利用SVM對蜂膠進行分類鑒別的模型，即隨機選取38個已知氣候帶的樣本作為訓(xùn)練集（總樣本量的1/2），剩余38個樣本作為測試集，利用十折交叉驗證（10-fold cr

9、oss validation）來驗證精度，并得到最優(yōu)懲罰因子（cost），SVM類型為C分類（C-classification），核函數(shù)為線性核函數(shù)，在最優(yōu)懲罰因子的條件下利用訓(xùn)練集進行樣本訓(xùn)練得到分類模型。對測試集樣本進行分類測試，得到分類結(jié)果。將此過程重復(fù)十次，并計算每次的測試正確率。得到平均正確率為90.27%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為13.88%。說明利用SVM作為分類模型對不同氣候帶 EaEP進行分類驗證時，能得到較好的分類結(jié)果，也證實了不

10、同氣候帶的EaEP活性成分與氣候帶之間存在一定關(guān)聯(lián)。
　　4.不同氣候帶蜂膠對 S.mutans生長的影響：測定不同氣候帶 EaEP對 S.mutans的MIC，通過計算各氣候帶EaEP對于S.mutans的MIC均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，發(fā)現(xiàn)暖溫帶EaEP的MIC相對較小，僅為130.0μg/mL，表現(xiàn)為其抑菌效果最好，而南亞熱帶EaEP的MIC均值為247.8μg/mL，并且統(tǒng)計學(xué)上與其他氣候帶的MIC有顯著性差異（P＜0.05），說明