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文檔簡介
1、軟骨發(fā)育不全是一種常染色體遺傳病,是人類侏儒最常見的類型,其發(fā)生主要是De novo基因突變的結(jié)果,目前尚無有效的治療方法。軟骨發(fā)育不全主要影響四肢骨、椎骨等長骨(Long Bone)的軟骨內(nèi)成骨(Endochondral Ossification)過程,尤其是軟骨生成(Chondrogenesis)過程,包括間充質(zhì)細(xì)胞集聚并分化為軟骨細(xì)胞,以及隨后軟骨細(xì)胞的增生、肥大和凋亡,但其機(jī)制目前并不完全清楚。 骺生長板軟骨細(xì)胞增生與分
2、化的調(diào)控,對長骨的縱向生長和骨骼的發(fā)育至關(guān)重要。長骨生長板受多種信號分子的調(diào)控,其中成纖維細(xì)胞生長因子及其受體(FibroblastGrowth Factors/Fibroblast Growth Factor Receptors,F(xiàn)GFs/FGFRs)在其中起重要作用。目前認(rèn)為,通過非配體依賴的自主激活,F(xiàn)GFR3的十多種功能增強(qiáng)型(Gain-of-function)點(diǎn)突變可引起多種人類軟骨發(fā)育障礙性侏儒,包括軟骨發(fā)育不全(Achon
3、droplasia,ACH)、季肋發(fā)育不全(Hypochondroplasia, HCH)、致死性骨發(fā)育不全(ThanatophoricDysplasia, TD)和嚴(yán)重軟骨發(fā)育不良伴發(fā)育遲緩和黑棘皮癥(Severe Achondroplasia with.Developmental Delay and Acanthosis Nigricans,SADDAN)等,其中95%以上的軟骨發(fā)育不全患者由FGFR3的功能增強(qiáng)型突變引起。
4、 Deng等發(fā)現(xiàn),F(xiàn)GFR3基因敲除小鼠(FGFR3-/-)有長骨過度生長、生長板增生軟骨細(xì)胞帶和肥大軟骨細(xì)胞帶變寬、軟骨細(xì)胞增殖活性增加;相反,Chen等人利用基因敲入技術(shù)建立了模擬人ACH的FGFR3G369C點(diǎn)突變小鼠模型(相當(dāng)于人源FGFR3G375C),這種小鼠FGFR3功能增強(qiáng),個體明顯短小,頭顱短圓,長骨生長板組織形態(tài)結(jié)構(gòu)異常,軟骨細(xì)胞增生帶短稀,增生能力減弱、肥大軟骨細(xì)胞明顯減少伴CollagenX表達(dá)減低(即軟骨細(xì)胞
5、分化能力降低),表明FGFR3是長骨軟骨生成的負(fù)性調(diào)節(jié)分子,影響軟骨細(xì)胞的增殖活性和分化。目前研究FGFR3突變引起的軟骨發(fā)育異常主要集中于STAT1/p21和ERK-MAPK信號通路上,但抑制此兩條信號通路,并不能完全緩解FGFR3突變所致的侏儒表型,提示可能存在其他信號通路參與了對軟骨發(fā)育異常的調(diào)控。 越來越多的研究表明PI3K/AKT信號通路在哺乳動物骨骼發(fā)育和細(xì)胞增殖分化中起重要作用,成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)、胰島
6、素樣生長因子(Insulin-like GrowthFactors,IGFs)、胰島素等對軟骨發(fā)育和功能重要的生長因子均能激活該通路。PTEN,即第10號染色體同源缺失性磷酸酶.張力蛋白基因(phosphatase and tensin homologdeleted on chromosome ten, PTEN),是PBK/AKT通路中一個重要的負(fù)性調(diào)控分子。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠成-軟骨前體細(xì)胞中敲除PTEN后影響生長板軟骨細(xì)胞的增殖與分化
7、。但是,該通路在FGFR3介導(dǎo)的軟骨發(fā)育不全中的作用目前尚不清楚,需要進(jìn)一步研究。 鑒于FGFR3在軟骨發(fā)育不全致病機(jī)理中的地位以及PBK/AKT活性在軟骨細(xì)胞增生抑制和分化延遲中的重要作用,本研究采用條件性基因敲除技術(shù)建立了軟骨細(xì)胞條件性敲除PTEN基因的FGFR3功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變小鼠模型,通過分析相關(guān)小鼠的表型,觀察在FGFR3功能增強(qiáng)型小鼠軟骨細(xì)胞特異性敲除PTEN基因后對軟骨發(fā)育的影響,并初步探討PTEN基因敲除影響軟骨
8、發(fā)育的可能的分子機(jī)制。 主要實(shí)驗(yàn)方法: 1.利用基于Cre/LoxP系統(tǒng)的條件性基因敲除技術(shù),建立了軟骨細(xì)胞特異性敲除PTEN基因的FGFR3功能增強(qiáng)型小鼠模型,PCR鑒定小鼠基因型及免疫熒光鑒定敲除效率; 2.采用X線攝影、全骨架染色和頭顱局部攝影,觀察小鼠大體形態(tài)及顱底軟骨聯(lián)結(jié)的變化情況,測定小鼠生長過程中體重、體長、軀干長、尾長和尾椎椎體長度的變化; 3.制備了不同年齡不同基因型小鼠的組織切片,通過
9、HE染色,觀察生長板形態(tài)和第二骨化中心的發(fā)育情況;通過BrdU摻入后免疫組化檢測,觀察生長板軟骨細(xì)胞增殖情況; 4.采用定量PCR檢測軟骨分化相關(guān)基因COL2A1、COL10A1和IHH的表達(dá)情況;Westem Blot檢測p-AKT水平,激光共聚焦顯微術(shù)檢測了軟骨組織中p-AKT的水平并進(jìn)行了定位觀察; 5.建立胎鼠脛骨及跖骨體外培養(yǎng)模型:采用bpV處理阻斷PTEN,觀測對跖骨生長率的影響。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
10、 一、軟骨細(xì)胞特異性敲除PTEN基因的FGFR3功能增強(qiáng)型小鼠的獲得 利用FGFR3功能增強(qiáng)點(diǎn)突變小鼠(Fgfr3G369C/+小鼠,即ACH小鼠),Ptenftox/flox小鼠以及軟骨細(xì)胞中特異表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠(Col2αCre小鼠)設(shè)計(jì)交配策略,獲得了基因型為Col2αCre:Ptenfiox/flox;ACH的小鼠。該小鼠為軟骨細(xì)胞特異性敲除PTEN基因的FGFR3功能增強(qiáng)型小鼠。采用免疫熒光化學(xué)對該小鼠
11、軟骨細(xì)胞中PTEN的表達(dá)情況進(jìn)行了鑒定,證實(shí)PTEN在軟骨細(xì)胞中因?yàn)榛蚯贸磉_(dá)顯著降低。 二、PTEN基因敲除對ACH小鼠一般生長情況的影響 1.PTEN基因敲除對ACH小鼠體重、體長、尾長、椎體長度的影響:①在觀測期3-10w內(nèi),CAP小鼠體重增長較AP小鼠明顯;②4w的CAP小鼠體長、尾長明顯長于AP小鼠,但是兩者椎體長度差異不顯著。 2.PTEN基因敲除對ACH小鼠頭顱及顱底軟骨聯(lián)結(jié)的影響:①CAP小鼠
12、頭顱圓鈍的狀況較AP小鼠有所改善;②CAP小鼠的顱底軟骨聯(lián)結(jié)閉合時(shí)間較AP小鼠延遲。 三、PTEN基因敲除對ACH小鼠軟骨內(nèi)成骨的影響 1.PTEN基因敲除對ACH小鼠軟骨細(xì)胞增殖的影響:出生5d和14d小鼠BrdU摻入檢測后發(fā)現(xiàn),CAP小鼠軟骨細(xì)胞增殖指數(shù)較AP小鼠高,提示:CAP小鼠軟骨細(xì)胞增殖活性較AP小鼠高; 2.PTEN基因敲除對ACH小鼠軟骨細(xì)胞分化的影響:觀察出生7d、12d小鼠的生長板,發(fā)現(xiàn)CAP
13、小鼠的第二骨化中心較AP小鼠的提前出現(xiàn),16d時(shí)CAP小鼠生長板軟骨細(xì)胞未增殖帶明顯較AP小鼠窄,提示:CAP小鼠軟骨細(xì)胞分化較AP小鼠快; 3.熒光定量PCR結(jié)果顯示:7d時(shí),AP小鼠關(guān)節(jié)軟骨中COL2A1 mRNA比CAP小鼠高,CAP小鼠COL10A1 mRNA表達(dá)較AP小鼠高,提示CAP小鼠軟骨細(xì)胞分化較AP小鼠加快。 4.PTEN基因敲除對ACH小鼠產(chǎn)生影響的可能機(jī)制:AP小鼠軟骨組織未檢測到p-AKT,而CA
14、P小鼠p-AKT水平顯著高于AP小鼠,提示:敲除PTEN后對ACH小鼠增殖與分化產(chǎn)生的影響可能是由于AKT磷酸化水平改變引起。 四、胎鼠脛骨體外培養(yǎng)模型的建立及阻斷PTEN后對胎鼠跖骨生長的影響 建立了ACH胎鼠(E16.5)脛骨體外培養(yǎng)7d,14d的模型,顯示ACH胎鼠脛骨生長率較野生慢。ACH胎鼠(E16.5)跖骨在給予不同濃度bpV后結(jié)果顯示:處理組跖骨生長率明顯較未處理組高,提示:給予bpV處理阻斷PTEN后,P
15、I3K/AKT通路活化,促進(jìn)了軟骨的生長。 主要結(jié)論: 通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,我們發(fā)現(xiàn)小鼠軟骨細(xì)胞特異性敲除PTEN基因可部分緩解由FGFR3功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變所引起的侏儒表型。主要表現(xiàn)為: 1.軟骨細(xì)胞特異性敲除PTEN的FGFR3功能增強(qiáng)型小鼠大體表型較FGFR3功能增強(qiáng)型小鼠有所緩解; 2.軟骨細(xì)胞特異性敲除PTEN的FGFR3功能增強(qiáng)型小鼠生長板軟骨細(xì)胞增殖活性較FGFR3功能增強(qiáng)型小鼠增高,提示P
16、TEN基因的條件性敲除,可以緩解FGFR3功能增強(qiáng)所致的軟骨細(xì)胞增殖抑制; 3.軟骨細(xì)胞特異性敲除PTEN的FGFR3功能增強(qiáng)型小鼠生長板軟骨細(xì)胞較AP小鼠軟骨細(xì)胞分化加快,提示PTEN基因敲除可緩解FGFR3功能增強(qiáng)所致的分化抑制; 4.PBK/AKT信號通路在軟骨發(fā)育中發(fā)揮重要作用,AKT活性降低是FGFR3功能增強(qiáng)所致軟骨細(xì)胞增殖抑制和分化延遲的重要機(jī)制之一。進(jìn)一步地采用bpV處理ACH胎鼠跖骨也發(fā)現(xiàn)阻斷PTEN使
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