自噬在軟骨發(fā)育不全與軟骨生成中的作用與機制研究.pdf

1、目的：
　　為了進一步驗證自噬在正常軟骨發(fā)育中的重要作用，我們引進了Atg7條件敲除小鼠(ATG7flox/flox)。雖然ATG7與ATG5屬于不同的ATG，但是兩者在自噬過程中發(fā)揮著同樣的不可或缺的作用，敲除或降低均會導(dǎo)致嚴重的自噬受抑。為此我們利用Col2a-cre轉(zhuǎn)基因小鼠，交配繁殖獲得在軟骨內(nèi)特異性敲除Atg7的小鼠。RNA水平及蛋白水平提示軟骨細胞中ATG7顯著降低，Western blotting發(fā)現(xiàn)突變小鼠自噬活性

2、顯著受抑。通過大體表型及組織學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)軟骨內(nèi)特異性敲除Atg7的小鼠四肢不成比例地縮短，同ACH類似，近端肢體縮短顯著。突變小鼠生長板軟骨細胞增殖標志基因PCNA表達降低，原代軟骨細胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后阿爾新藍染色較野生小鼠變淺，這些提示突變小鼠增殖及分化受抑。軟骨內(nèi)敲除Atg7導(dǎo)致骨骼生長異常提示自噬在正常軟骨生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，從動物水平進一步驗證了我們前期細胞及胚胎期骨頭培養(yǎng)的結(jié)論。
　　總的來說，我們發(fā)現(xiàn)自噬在維

3、持軟骨細胞正常生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并且ATG12-ATG5復(fù)合物蛋白水平降低介導(dǎo)的自噬受抑可能參與了FGF/FGFR3所致軟骨發(fā)育不全的調(diào)控過程，這可能為軟骨發(fā)育及軟骨發(fā)育不全相關(guān)分子機制提供新的理解，從而有可能為FGFR3介導(dǎo)的軟骨發(fā)育不全提供新的治療策略。
　　方法:
　　第一部分自噬在FGF/FGFR3所致軟骨發(fā)育不全中的作用
　　1.利用小鼠軟骨細胞檢測FGF/FGFR3對自噬活性的影響
　　1)免疫

4、組化檢測ACH小鼠及同窩對照野生小鼠脛骨生長板軟骨細胞中自噬標志物L(fēng)C3的表達;
　　2)分離ACH及同窩對照野生小鼠的原代軟骨細胞，Western blotting檢測內(nèi)源LC3轉(zhuǎn)換率;
　　2.體外檢測增加FGFR3表達或FGF-2處理后對自噬活性的調(diào)控
　　1) RCS細胞中，瞬時轉(zhuǎn)染FGFR3，血清饑餓并結(jié)合溶酶體蛋白酶抑制劑(E64d+PEPS A)處理4小時，Western blotting檢測內(nèi)源LC3轉(zhuǎn)

5、換率;
　　2) ATDC5細胞中，血清饑餓12-14小時后，F(xiàn)GF-2結(jié)合溶酶體蛋白酶抑制劑(E64d+PEPS A)處理30min，Western blotting檢測內(nèi)源LC3轉(zhuǎn)換率;
　　3.體外檢測自噬抑制劑對軟骨生成過程的作用
　　1)兩種自噬抑制劑（3MA及氯喹）處理胚胎期野生型小鼠跖骨，利用內(nèi)置彩色數(shù)碼相機Spot分別于培養(yǎng)0天、4天、7天對跖骨進行拍照，利用IPP6.0軟件測量跖骨軟骨帶及礦化帶長度，

6、統(tǒng)計分析;
　　2)氯喹與FGF-2處理胚胎期野生型小鼠跖骨及脛骨，利用內(nèi)置彩色數(shù)碼相機Spot分別于培養(yǎng)0天、4天對跖骨與脛骨進行拍照，利用IPP6.0軟件測量跖骨軟骨帶及礦化帶長度，統(tǒng)計分析。在培養(yǎng)4天后將骨頭進行固定，制備石蠟切片，阿爾新藍染色分析氯喹及FGF-2對骨頭生長板軟骨細胞增殖分化的影響;
　　第二部分 FGF/FGFR3負性調(diào)控自噬活性的相關(guān)分子機制
　　1.FGF/FGFR3對ATG12-ATG5復(fù)

7、合物蛋白水平的影響
　　1)分離ACH及同窩對照野生小鼠的原代軟骨細胞，Western blotting檢測內(nèi)源ATG12-ATG5復(fù)合物蛋白水平;
　　2)分離R3KO及同窩對照野生小鼠的原代軟骨細胞，Western blotting檢測內(nèi)源ATG12-ATG5復(fù)合物蛋白水平;
　　2.FGFR3與ATG5外源相互作用的檢測
　　1)293T細胞，免疫共沉淀檢測FGFR3與ATG5外源相互作用（FGFR3共沉淀

8、ATG5或ATG5共沉淀FGFR3）;
　　2)293T細胞，GST Pull Down檢測FGFR3與ATG5的相互作用;
　　3.FGFR3與ATG5內(nèi)源相互作用的檢測
　　1) HeLa細胞，瞬時轉(zhuǎn)染FGFR3，免疫共沉淀檢測外源FGFR3與內(nèi)源ATG5的半內(nèi)源相互作用;
　　2) HeLa細胞，免疫共沉淀檢測內(nèi)源FGFR3與ATG5相互作用;
　　4.檢測ATG12-ATG5介導(dǎo)的自噬對軟骨增殖活性

9、及分化的作用
　　1)利用慢病毒RNAi-Atg5，構(gòu)建穩(wěn)定表達RNAi-Atg5的ATDC5細胞系;
　　2)定量PCR檢測RNAi Atg5效率;
　　第三部分軟骨內(nèi)特異性敲除Atg7后對軟骨生成的影響及可能的機制研究
　　1.通過ATG7 flox/flox小鼠與Col2a-cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配繁殖獲得軟骨內(nèi)特異性敲除Atg7的小鼠（ATG7flox/fl ox: Col2a-cre）
　　2.檢測軟

10、骨內(nèi)特異性敲除Atg7小鼠軟骨細胞中ATG7敲除效率；
　　3.軟骨內(nèi)特異性敲除Atg7小鼠表型分析
　　1)X光檢測出生后突變小鼠與同窩野生小鼠大體的差異;
　　2)X光檢測出生后7天、1m、2m齡小鼠脛骨、股骨，并測量長度;
　　4.探索軟骨內(nèi)敲除Atg7致肢體不成比例縮短的可能機制
　　1)免疫組化檢測軟骨內(nèi)敲除Atg7后對小鼠脛骨生長板軟骨細胞增殖活性的影響(PCNA);
　　2)阿爾新藍染色

11、檢測軟骨內(nèi)敲除Atg7后對其原代軟骨細胞分化的影響;
　　結(jié)果:
　　第一部分 FGF/FGFR3信號通負性調(diào)控自噬活性
　　1.FGFR3信號通路抑制小鼠軟骨細胞自噬活性
　　1)免疫組化檢測ACH小鼠及同窩對照野生小鼠脛骨生長板軟骨細胞中自噬標志物L(fēng)C3的表達，結(jié)果提示ACH小鼠生長板軟骨細胞LC3信號彌散，強度降低;
　　2)小鼠原代軟骨細胞，ACH較同窩對照野生小鼠內(nèi)源LC3轉(zhuǎn)換率降低;
　　

12、2.體外增加FGFR3表達或FGF-2處理后抑制細胞自噬活性
　　1) RCS細胞中，瞬時轉(zhuǎn)染FGFR3，血清饑餓并結(jié)合溶酶體蛋白酶抑制劑(E64d+PEPS A)處理4小時，Western blotting結(jié)果提示FGFR3抑制內(nèi)源LC3轉(zhuǎn)換率;
　　2)ATDC5細胞中，血清饑餓12-14小時后，F(xiàn)GF-2處理結(jié)合溶酶體蛋白酶抑制劑(E64d+PEPS A)處理30min，Western blotting結(jié)果提示FGF-

13、2激活信號通路后抑制內(nèi)源LC3轉(zhuǎn)換率;
　　3.體外檢測自噬抑制劑對軟骨生成過程的作用
　　1)兩種自噬抑制劑（3MA及氯喹）均抑制胚胎期野生型小鼠跖骨生長，特別是軟骨生長;
　　2)氯喹與FGF-2作用類似，抑制胚胎期野生型小鼠跖骨及脛骨的軟骨生長，胚胎期骨頭生長板軟骨細胞增殖帶及肥大帶長度顯著縮短。
　　第二部分 FGF/FGFR3負性調(diào)控ATG12-ATG5復(fù)合物蛋白水平，并與該復(fù)合物存在相互作用
　

14、　1.FGF/FGFR3降低ATG12-ATG5復(fù)合物蛋白水平
　　1)小鼠原代軟骨細胞，ACH小鼠的ATG12-ATG5復(fù)合物蛋白水平較同窩對照顯著降低;
　　2)小鼠原代軟骨細胞，R3KO小鼠的ATG12-ATG5復(fù)合物蛋白水平較同窩對照顯著增加;
　　2.FGFR3與ATG5外源相互作用檢測
　　1)293T細胞，免疫共沉淀結(jié)果提示FGFR3與ATG5存在外源相互作用(FGFR3共沉淀ATG5或ATG5共沉

15、淀FGFR3);
　　2)293T細胞，GSTPullDown提示FGFR3與ATG5存在相互作用;
　　3.FGFR3與ATG5內(nèi)源相互作用檢測
　　1) HeLa細胞，外源FGFR3能夠免疫共沉淀內(nèi)源ATG5;
　　2) HeLa細胞，內(nèi)源ATG5能夠免疫共沉淀內(nèi)源FGFR3;
　　4.檢測ATG12-ATG5介導(dǎo)的自噬對軟骨增殖活性及分化的影響
　　1)利用慢病毒RNAi-Atg5載體，成功構(gòu)建

16、穩(wěn)定表達RNAi-Atg5的ATDC5細胞系;
　　2)定量PCR結(jié)果提示慢病毒RNAi Atg5后Atg5表達顯著降低;
　　第三部分軟骨內(nèi)特異性敲除Atg7后骨骼生長異常，四肢骨縮短
　　1.成功獲得軟骨內(nèi)特異性敲除Atg7的小鼠;
　　2.軟骨內(nèi)特異性敲除Atg7的小鼠原代軟骨細胞中ATG7顯著降低;
　　3.軟骨內(nèi)特異性敲除Atg7小鼠表型分析
　　結(jié)論：
　　1.FGF/FGFR3信號

17、通路負性調(diào)控軟骨細胞自噬活性;
　　2.自噬抑制劑通過抑制軟骨增殖活性及分化抑制軟骨生成過程;
　　3.FGF/FGFR3信號通路負調(diào)控ATG12-ATG5復(fù)合物蛋白水平;
　　4.FGFR3與ATG12-ATG5復(fù)合物存在相互作用，并通過激酶區(qū)與ATG5結(jié)合;
　　5.ATG12-ATG5介導(dǎo)的自噬在軟骨發(fā)育特別是對軟骨細胞增殖、分化有重要作用;
　　6.過表達ATG5可部分緩解FGF/FGFR3所介導(dǎo)的