miR-221下調(diào)RAD51并提高化療藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用.pdf

1、DNA雙鏈斷裂（Double strand breaks，DSBs）是一種非常嚴(yán)重的DNA損傷。DSBs如果不能修復(fù)則可能導(dǎo)致染色體的斷裂以及細(xì)胞死亡，若修復(fù)不當(dāng)可能致使染色體發(fā)生缺失、易位和倒位等重排，從而易于導(dǎo)致腫瘤等相關(guān)疾病。生物體存在多種DNA修復(fù)系統(tǒng)以保證基因組的完整性。DSBs的主要修復(fù)方式有同源重組修復(fù)（Homologous recombination repair，HRR）和非同源末端連接(Non-homologous

2、end joining，NHEJ)修復(fù)，其中同源重組修復(fù)是S期DSBs修復(fù)最主要的方式。當(dāng)DNA發(fā)生了雙鏈斷裂(DSBs)，基因組內(nèi)序列相同的DNA即可被當(dāng)作模板來修復(fù)斷裂。真核細(xì)胞中的RAD51蛋白是DNA同源重組修復(fù)中的關(guān)鍵性蛋白質(zhì)。RAD51在人類多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而RAD51的高表達(dá)可能致使腫瘤產(chǎn)生耐藥性。因此如何有效的下調(diào)細(xì)胞內(nèi)RAD51的水平從而使提高腫瘤的治療效果是目前需要解決的問題。
　　MicroRNA(mi

3、RNA)是近年來在多種真核細(xì)胞以及病毒中發(fā)現(xiàn)的微小的非編碼單鏈RNA。microRNA基于與靶基因mRNA的序列部分或全部互補(bǔ)對靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控。microRNA被發(fā)現(xiàn)作用于DNA損傷修復(fù)網(wǎng)絡(luò)的許多環(huán)節(jié)，因此尋找能夠參與調(diào)控DNA修復(fù)的miRNA以及其調(diào)控靶點(diǎn)非常重要。
　　我們通過軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-221可能作用于RAD51mRNA。我們通過高表達(dá)或抑制miR-221驗證了miR-221對RAD51的負(fù)調(diào)控，發(fā)現(xiàn)mi

4、R-221可降低DNA同源重組修復(fù)的效率以及基因組穩(wěn)定性。miR-221造成腫瘤細(xì)胞在藥物處理下的生存率降低。
　　[研究目的]
　　本課題研究了人類骨肉瘤細(xì)胞(U2OS)中，miR-221對RAD51的調(diào)控作用，并研究其在細(xì)胞增殖、DNA雙鏈斷裂修復(fù)以及細(xì)胞對化療藥物敏感性等方面的作用。
　　[研究方法]
　　生物信息學(xué)軟件預(yù)測可能作用于RAD51的microRNA，篩選出候選miR-221。
　　利用慢

5、病毒轉(zhuǎn)染將miR-221導(dǎo)入人類成骨肉瘤(U2OS)細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)miR-221的細(xì)胞系，利用Western blotting檢測miR-221對細(xì)胞中RAD51蛋白水平的影響。
　　構(gòu)建含RAD51 mRNA 3'UTR的熒光素酶報告系統(tǒng)，研究miR-221對RAD51的負(fù)調(diào)控。
　　通過免疫熒光方法檢測DNA雙鏈損傷標(biāo)記γ-H2AX及同源重組修復(fù)過程中的關(guān)鍵步驟RAD51焦點(diǎn)形成。
　　通過計數(shù)微核發(fā)生評估基因

6、組不穩(wěn)定性。
　　利用MTT法檢測藥物處理后細(xì)胞生存率。
　　[實(shí)驗結(jié)果]
　　1.Western blotting結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-221的成骨肉瘤U2OS細(xì)胞中RAD51蛋白水平明顯下調(diào)。
　　2.X射線照射后，miR-221轉(zhuǎn)染細(xì)胞中RAD51焦點(diǎn)數(shù)目少于對照（miR-neg），表明同源重組修復(fù)過程受阻。
　　3.使用電離輻射處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-221細(xì)胞組γ-H2AX陽性細(xì)胞比例數(shù)高于miR-n

7、eg細(xì)胞組，表明轉(zhuǎn)染miR-221后DNA雙鏈斷裂的修復(fù)受阻。同時miR-221組γ-H2AX陽性微核頻率也高于miR-neg組，表明miR-221導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性升高。
　　4.含RAD51 3'UTR的熒光素酶報告基因顯示，轉(zhuǎn)染miR-221之后熒光素酶表達(dá)量下降，表明miR-221可負(fù)調(diào)控RAD51。
　　5.轉(zhuǎn)染miR-221抑制劑到U2OS細(xì)胞中，檢測RAD51蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示在miR-221表達(dá)受到抑制時RA