東方田鼠非酒精性脂肪肝模型的建立及研究.pdf

1、目的:
　　非酒精性脂肪肝(nonalcoholicfattyliverdisease,NAFLD)發(fā)病率逐年增高,且有進(jìn)展到肝纖維化肝硬化的趨勢,目前其確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。我們在以往的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)東方田鼠有易發(fā)脂肪肝的傾向,因此建立東方田鼠非酒精性脂肪肝模型,利用SMART(SwitchingMechanismat5’endofRNATranscript,RNA5’端轉(zhuǎn)錄機(jī)制)技術(shù)構(gòu)建了東方田鼠肝臟cDNA(complemen

2、taryDNA,互補(bǔ)DNA)質(zhì)粒文庫,在此基礎(chǔ)上篩選與東方田鼠脂肪肝發(fā)病相關(guān)的基因,并獲得其全長序列,為進(jìn)一步研究非酒精脂肪肝發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　選取105只6周齡洞庭湖種群雄性東方田鼠,隨機(jī)分成三組,每組35只,分別為對(duì)照組、模型組1和模型組2,各組分別飼喂高纖維料(在大小鼠基礎(chǔ)料的基礎(chǔ)上加粗纖維,使粗纖維含量為10％,粗脂肪含量為3％)、高脂料(在大小鼠基礎(chǔ)料的基礎(chǔ)上加5％豬油、0．5％膽固醇和0．1％膽

3、鹽)、大小鼠基礎(chǔ)料。各組分別于造模開始后第2、4、6、8、12周處死,稱量體重及肝重,計(jì)算肝指數(shù),采血檢測東方田鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、堿性磷酸酶(ALP)、游離脂肪酸(FFA)、血糖(GLU)、r-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(r-GGT)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和膽堿酯酶(CHE),并取肝臟HE染色后做病理學(xué)觀察。通過文獻(xiàn)確定,可能與非酒精性脂肪肝相關(guān)的基因

4、,參照NCBI中大小鼠基因cDNA序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)其特異性引物,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測,比較基因動(dòng)態(tài)表達(dá)水平。
　　選取12月齡洞庭湖種群東方田鼠4只,取肝臟組織,提取總RNA,用SMART技術(shù)構(gòu)建東方田鼠肝臟cDNA質(zhì)粒文庫,測定文庫滴度和容量,并隨機(jī)挑選單個(gè)菌落測序,計(jì)算全長基因的比率。
　　根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果確定目的基因,通過PCR方法篩選cDNA質(zhì)粒文庫,獲得目的菌落,用pBluescriptIISK通用

5、引物M13R測序,獲得基因的全長序列,并進(jìn)行序列分析比較。
　　結(jié)果:
　　模型組1東方田鼠肝細(xì)胞均呈現(xiàn)彌漫性脂肪變性,模型組2東方田鼠肝細(xì)胞脂肪變性較輕,對(duì)照組東方田鼠肝臟基本正常。
　　與對(duì)照組相比,模型組1肝重和肝指數(shù)都明顯升高(P＜0．05),血清ALT、AST、TC、FFA、r-GGT、LDL、CHE和GLU都明顯升高(P＜0．05),HDL和TG均明顯降低(P＜0．05),ALP無明顯差異(P＞0．05);

6、對(duì)8個(gè)基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示肝組織中的CYP2E1(細(xì)胞色素P4502E1)、ECHSl(烯酰輔酶A水合酶短鏈l)、CYP2D5(細(xì)胞色素P4502D5)、CYP2a3a(細(xì)胞色素P4502a3a)和PGC-1(過氧化物酶體增殖物激活受體輔激活因子1)這5基因表達(dá)上調(diào)(P＜0．05),SC4MOL(固醇甲基氧化酶)、Adipor(脂聯(lián)素受體)和AMPK-1(腺苷酸活化激酶-1)這3個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(P＜0．05)。
　

7、　與對(duì)照組相比,模型組2肝重和肝指數(shù)明顯升高(P＜0．05),血清FFA、LDL、CHE顯著升高(P＜0．05),HDL明顯降低(P＜0．05),其余指標(biāo)與對(duì)照組相比無顯著差異;實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示所測基因未有明顯改變(P＞0．05)。
　　利用SMART技術(shù)構(gòu)建了東方田鼠肝臟cDNA質(zhì)粒文庫,該cDNA文庫滴度為1076pfu/μL,重組率約94％,庫容量達(dá)1.08×106測定了22個(gè)克隆序列經(jīng)BLAST分析,與GenBa

8、nk中大鼠、小鼠、田鼠以及人類已知功能蛋白具有75％以上的同源性,基因完整性比率為77．3％。
　　克隆了CYP2E1、CYP2D5、ECHSl三個(gè)基因,并獲得了它們的全長cDNA序列。CYP2E1基因cDNA全長為1685bp,有1482bp的完整開放閱讀框,編碼494個(gè)氨基酸;CYP2D5基因cDNA全長為1690bp,有1514bp的完整開放閱讀框,編碼504個(gè)氨基酸;ECHSl基因cDNA全長為1013bp,有873bp的