三種鼠原位移植性肝癌模型構(gòu)建與應(yīng)用研究.pdf

1、背景:
　　原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Primary Hepatocellular Carcinoma，PHC)是指發(fā)生在人體肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上等細(xì)胞的惡性腫瘤性疾病，是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一。我國(guó)的肝癌患病率及病死率均為世界第一位[1-2]，術(shù)后極容易復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[3-5]，而且化療耐藥，5年存活率較低[6-7]，因此需要深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)理，探索新的治療方法。許多人體實(shí)驗(yàn)由于倫理學(xué)的限制，導(dǎo)致許多藥物試驗(yàn)方法不可應(yīng)用于人。所以建立符合臨床

2、肝癌發(fā)生與發(fā)展特點(diǎn)和疾病變化規(guī)律的動(dòng)物模型是所必需的。肝癌動(dòng)物模型主要分為誘導(dǎo)性肝癌模型和移植肝癌兩大類(lèi)。由于肝癌誘癌建模的時(shí)間長(zhǎng)，單純靶向成肝癌的成模率有待提高，均影響肝癌誘癌動(dòng)物模型的應(yīng)用，因此移植性肝癌模型就成為重要的研究對(duì)象。
　　目前，人肝癌-鼠模型是肝癌研究應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物模型，其中常見(jiàn)的模型是人類(lèi)肝癌細(xì)胞系或組織塊接種于裸鼠、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷鼠(SCID)等免疫功能缺陷小鼠，解決許多肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和治療機(jī)制等基礎(chǔ)研究

3、的問(wèn)題，但此類(lèi)模型特點(diǎn)是免疫缺陷，只是將小鼠作為肝癌研究的“反應(yīng)器”，缺乏免疫系統(tǒng)對(duì)肝癌的影響因素。因此，本研究著重關(guān)注和構(gòu)建不同免疫狀況大、小鼠移植性肝癌模型，以肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的常見(jiàn)途徑，以鼠源的Walker-256細(xì)胞系與人源HepG2肝癌細(xì)胞系為細(xì)胞來(lái)源，通過(guò)肝葉注射和門(mén)靜脈注射，建立模擬肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的大、小鼠原位移植性肝癌模型，以此模型盡量模擬臨床肝癌的惡性生物學(xué)行為特點(diǎn)，并將其中大鼠模型應(yīng)用于臨床射頻消融的實(shí)驗(yàn)性治療和療效判

4、定研究。此外，鼠源的Walker-256細(xì)胞系還可模擬繼發(fā)的轉(zhuǎn)移性肝癌的臨床發(fā)生過(guò)程。以此研究為肝癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及繼發(fā)的轉(zhuǎn)移性肝癌的發(fā)生機(jī)制和干預(yù)治療提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。
　　目的:正常免疫和免疫抑制劑干預(yù)狀態(tài)下，構(gòu)建三種鼠原位移植性肝癌模型，為轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性肝癌提供實(shí)驗(yàn)研究的動(dòng)物模型，并嘗試將大鼠模型應(yīng)用于臨床射頻消融實(shí)驗(yàn)性治療和療效判定研究。
　　方法:選取鼠源Walker-256細(xì)胞系與人源HepG2肝癌細(xì)胞系，分別針

5、對(duì)正常免疫狀態(tài)大鼠和肝移植后“三聯(lián)免疫抑制方案”免疫抑制小鼠，采用肝葉直接注射法和肝內(nèi)門(mén)靜脈注射法，建立三種原位移植性鼠肝癌模型，并形成以下分組:①門(mén)靜脈-Walker-256組:門(mén)靜脈注射Walker-256-鼠原位移植性肝癌模型，SD大鼠30只;②肝葉-Walker-256組:肝葉注射Walker-256-鼠原位移植性肝癌模型，SD大鼠30只;③門(mén)靜脈-HepG2組:門(mén)靜脈注射人HepG2肝癌細(xì)胞-免疫抑制Balb/c小鼠原位移植性

6、肝癌模型，小鼠15只，三聯(lián)免疫抑制方案為甲基強(qiáng)的松龍、他克莫司和嗎替麥考酚酯。肝癌鼠模型觀察指標(biāo)為:①動(dòng)物一般情況與成瘤率、腫瘤大小、肝臟及其鄰近臟器浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移情況;②病灶組織HE染色光鏡觀察;③大鼠模型高頻超聲超影像學(xué)觀察:;④動(dòng)態(tài)觀察小鼠模型體重、白細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類(lèi)。此外，大鼠原位移植性鼠肝癌模型還用于射頻消融治療的實(shí)驗(yàn)性研究，取射頻消融病灶與周?chē)M織，進(jìn)行以下檢測(cè):①:HE染色光鏡觀;②細(xì)胞凋亡TUNEL染色。
　　結(jié)果:三種方

7、法均能成功構(gòu)建鼠原位移植性肝癌模型，成模時(shí)間在9～15天之間，成瘤率在14.3％～33.3％之間，其中高頻超聲檢測(cè)門(mén)靜脈-Walker-256組與肝葉-Walker-256組模型大鼠，可發(fā)現(xiàn)肝葉腫瘤，主要體為圓形或橢圓形的不規(guī)則低回聲團(tuán)，內(nèi)部回聲不均勻。HE染色顯微鏡下觀為腫瘤細(xì)胞呈條索及團(tuán)塊狀排列，胞核大濃染，異型性明顯，胞質(zhì)量少，為轉(zhuǎn)移性肝癌的特點(diǎn)。大鼠肝癌模型射頻消融干預(yù)后，以進(jìn)針點(diǎn)為中心，遞次向外延伸區(qū)域鏡下可見(jiàn)明顯的壞死區(qū)、凋

8、亡壞死混合區(qū)和凋亡為主區(qū)域，其中前兩區(qū)域有大量的炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，后兩區(qū)域可見(jiàn)有少量殘余的腫瘤細(xì)胞。在門(mén)靜脈-HepG2組小鼠原位移植肝癌模型，模型小鼠白細(xì)胞數(shù)為8.87±4.25％;中性粒細(xì)胞所占比例數(shù)值為66.78±14.49％，淋巴細(xì)胞所占比例數(shù)為18.36±11.07％，單核細(xì)胞9.45±7.00％，小鼠體重變化呈逐步下降趨勢(shì)，與正常比較有明顯差距。病理取材瘤體大?。ㄖ睆剑?.0mm。光鏡下病理學(xué)觀察為，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核較大分