片狀工程化肝組織體外構(gòu)建及大鼠原位移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：肝移植是終末期肝病的有效治療手段，但供肝的嚴(yán)重缺乏一直制約其發(fā)展，因此解決這一難題必須尋求新的治療技術(shù)。肝組織工程是利用肝臟細(xì)胞與載體支架復(fù)合構(gòu)建可植入的類肝組織，具有緩解器官供體短缺的治療前景。從研究角度，由于肝臟血供豐富，較大尺度類肝組織在大鼠肝臟原位移植手術(shù)操作困難，至今缺乏安全有效的方法。本課題擬在體外構(gòu)建較大尺度工程化肝組織并探索在大鼠體內(nèi)原位移植的方法，為開(kāi)辟一種新的治療途徑奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　目的：為解決較大尺

2、度類肝組織體內(nèi)移植后難以存活的問(wèn)題，本項(xiàng)目擬在體外構(gòu)建預(yù)血管化的片狀工程化肝組織，并在大鼠肝臟表面制造輕度滲血?jiǎng)?chuàng)面后將植入物貼覆其上，使構(gòu)建物與肝臟盡快建立血液聯(lián)通，以探索將大塊工程化肝組織與原位肝臟整合的新方法。
　　方法：1.種子細(xì)胞的制備：胰酶冷消化法獲得新生大鼠肝細(xì)胞，肺組織塊貼壁法分離大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)。四唑鹽(MTT)比色法評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖活性，免疫熒光法檢測(cè)肝細(xì)胞白蛋白表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞CD31的表達(dá)。

3、　　2.五種片狀支架材料細(xì)胞相容性的體外評(píng)價(jià)：仿血管束支架材料、海綿狀膠原材料、薄膜狀膠原材料、聚乳酸、殼聚糖表觀形貌及掃描電鏡觀察。新生大鼠肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞分別與五種材料共培養(yǎng)。運(yùn)用掃描電鏡觀察細(xì)胞/材料黏附情況，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，白蛋白、尿素氮檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肝細(xì)胞功能。3.片狀工程化肝組織體外構(gòu)建兩步法：首先將內(nèi)皮細(xì)胞/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與體積>1cm3的片狀支架材料復(fù)合并共培養(yǎng)兩小時(shí)；再將肝細(xì)胞與預(yù)血管化處理的支架材料復(fù)

4、合1小時(shí)，構(gòu)建成片狀工程化肝組織。4.大鼠的肝表面貼覆移植(n=15)：先將肝臟包膜造成輕微滲血?jiǎng)?chuàng)面，再將構(gòu)建的片狀類肝組織以肝表面貼覆的方法植入，醫(yī)用纖維蛋白膠噴灑固定，4周后取材進(jìn)行大體觀察及組織切片HE染色、白蛋白及CD31免疫組化染色。
　　結(jié)果：1.分離得到的新生大鼠肝細(xì)胞約為1.5×106/鼠肝，活率95％以上，呈團(tuán)簇生長(zhǎng)。MTT值在培養(yǎng)7d升至峰值，隨后逐漸下降。白蛋白染色陽(yáng)性；分離得到的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞貼壁率約

5、為80％，原代細(xì)胞存活率達(dá)98％以上。貼壁后呈單層鑲嵌排列鋪路石狀。MTT值在2-4天成倍數(shù)生長(zhǎng)。CD31染色陽(yáng)性。2.五種材料表觀形貌各有不同，種子細(xì)胞與支架復(fù)合后，電鏡下觀察細(xì)胞分布以海綿狀膠原材料最適合細(xì)胞黏附。細(xì)胞的增殖情況經(jīng)MTT檢測(cè)顯示：肝細(xì)胞的增殖依次為海綿狀膠原材料>仿血管束支架材料>薄膜狀膠原材料>殼聚糖>聚乳酸；內(nèi)皮細(xì)胞的增殖依次為海綿狀膠原材料>仿血管束支架材料>薄膜狀膠原材料>殼聚糖>聚乳酸。肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中白蛋

6、白和尿素的含量測(cè)定表明海綿狀膠原材料結(jié)果最佳；經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)篩選后，選擇海綿狀膠原材料作為后續(xù)構(gòu)建工程化肝組織的載體支架。3.體外構(gòu)建的片狀工程化肝組織大小約(1.5×1.5×0.6)cm3，鏡下觀察可見(jiàn)：海綿狀膠原材料上，預(yù)培養(yǎng)2小時(shí)的血管內(nèi)皮細(xì)胞已圍繞膠原細(xì)絲貼壁聚集成團(tuán)，達(dá)到了預(yù)血管化的目的。大量肝細(xì)胞被膠原細(xì)絲包繞密集成團(tuán)，幾乎布滿所有孔隙。4.片狀工程化肝組織通過(guò)肝表面貼覆法能夠簡(jiǎn)便安全地植入大鼠肝臟原位，并且與受體肝臟完全整合，

7、形成體積>1cm3的新生組織，H.E.染色顯示新生組織內(nèi)肝細(xì)胞形態(tài)良好，相互連接成片，內(nèi)皮細(xì)胞可在組織內(nèi)部形成大小不等的管腔，內(nèi)有紅細(xì)胞分布。免疫組化染色顯示新生組織表達(dá)白蛋白，內(nèi)部形成的管腔表達(dá)CD31。
　　結(jié)論：1.新生大鼠肝細(xì)胞及肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞分別可以通過(guò)胰酶冷消化法及組織塊貼壁法簡(jiǎn)便、高效的獲得，在體外培養(yǎng)條件下具有增殖活性且保持原有的分泌功能，可以作為構(gòu)建工程化肝組織的種子細(xì)胞應(yīng)用于肝組織工程研究。2.海綿狀膠原材料