復(fù)合型組織工程化自體皮膚體外快速構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文研究目的：尋找一種體外快速構(gòu)建復(fù)合型組織工程化自體皮膚的可行方法，為大面積燒創(chuàng)傷創(chuàng)面的覆蓋快速提供足夠的自體皮膚。 研究方法：含表皮干細(xì)胞的表皮細(xì)胞群的分離(三種分離方法的比較)：分別應(yīng)用Ⅰ型膠原酶法、胰蛋白酶法及中性蛋白酶法，進(jìn)行人皮膚組織表皮細(xì)胞群的分離。前者分離所得的表皮層及后兩者分離表皮層后的真皮層，均進(jìn)行組織學(xué)切片，蘇木素-伊紅(H-E)染色觀察，三者所得表皮細(xì)胞群均經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其中角蛋白19(K19)陽(yáng)性細(xì)胞

2、的百分比。含表皮干細(xì)胞的表皮細(xì)胞群的鑒定及培養(yǎng)：Ⅰ型膠原酶法分離的表皮細(xì)胞群，分別進(jìn)行K19-異硫氰酸熒光素(FITC)及β1-整合素(integrin)-氰3(Cy3)免疫熒光鑒定，克隆形成率試驗(yàn)，并對(duì)比培養(yǎng)基添加角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)與否對(duì)表皮細(xì)胞群生長(zhǎng)曲線的影響，應(yīng)用絲裂霉素-C處理后的人成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)表皮細(xì)胞群，觀察其體外增殖情況。成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定：Ⅰ型膠原酶法分離表皮細(xì)胞時(shí)的消化剩液經(jīng)過(guò)濾離心后，所得細(xì)胞進(jìn)

3、行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，光鏡下觀察形態(tài)，并行波形蛋白(vimentin)-FITC免疫熒光鑒定。復(fù)合型組織工程化自體皮膚的構(gòu)建：表皮細(xì)胞群以1×105個(gè)/cm2直接接種于脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)的乳頭面，約第7天時(shí)，翻轉(zhuǎn)ADM再接種已擴(kuò)增的成纖維細(xì)胞，收集標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)切片H-E染色，表皮層細(xì)胞計(jì)數(shù)，設(shè)培養(yǎng)基添加KGF組及不添加組。構(gòu)建皮膚修復(fù)裸鼠全層皮膚缺損的初步實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建皮膚移植于裸鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面，設(shè)三組對(duì)照，對(duì)照一：裸鼠自體全厚皮

4、片移植(將背部一側(cè)取下皮膚移植于另一側(cè))，對(duì)照二：?jiǎn)渭傾DM移植，對(duì)照三：裸露創(chuàng)面不做修復(fù)。修復(fù)后約6周，收集實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)區(qū)皮膚，進(jìn)行組織學(xué)切片H-E染色，抗人角蛋白10(K10)-FITC及K19-FITC免疫熒光檢測(cè)。 研究結(jié)果：Ⅰ型膠原酶法分離所得的表皮細(xì)胞群中K19陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞最高可接近17％，比胰蛋白酶法及中性蛋白酶法高。表皮細(xì)胞群中，K19-FITC及β1-integrin-Cy3免疫熒光鑒定顯示有K19陽(yáng)性及β1-i

5、ntegrin較高表達(dá)的細(xì)胞，其克隆形成率介于1％-8％之間；表皮細(xì)胞單純體外培養(yǎng)困難，添加KGF后，增殖較快，且分化有所減緩，但仍漸分化成復(fù)層，并脫落；人成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)的表皮細(xì)胞群，于約第3天時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)克隆樣增殖，并漸出現(xiàn)復(fù)層化，經(jīng)幾次換液后，復(fù)層化細(xì)胞脫落，殘留細(xì)胞開(kāi)始呈現(xiàn)單層克隆樣增殖，于約14天時(shí)漸推開(kāi)成纖維細(xì)胞，形成融合，但仍無(wú)法維持繼續(xù)傳代。Ⅰ型膠原酶法分離表皮細(xì)胞時(shí)，可同期獲得成纖維細(xì)胞，體外培養(yǎng)擴(kuò)增較容易，約7天左

6、右即可擴(kuò)增100倍，vimentin-FITC免疫熒光染色呈陽(yáng)性染色。利用先期接種表皮細(xì)胞于ADM，再接種已擴(kuò)增的成纖維細(xì)胞，并應(yīng)用添加KGF的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，可以快速構(gòu)建出超過(guò)30倍于原取材面積的皮膚，表皮層連續(xù)，細(xì)胞層數(shù)多為2-3層，部分分層較好，表皮層與真皮層之間的粘著均不緊密，真皮中含有成纖維細(xì)胞；表皮層細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，KGF添加組細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于未添加組。所構(gòu)建皮膚能夠較好的修復(fù)皮膚缺損創(chuàng)面，創(chuàng)區(qū)皮膚表皮層分層好，均有3-4層細(xì)

7、胞覆蓋，真皮層膠原排列有序，成纖維細(xì)胞分布均勻，未見(jiàn)皮膚附屬器，與裸鼠自體全厚皮片移植修復(fù)后的皮膚組織結(jié)構(gòu)基本接近；抗人K10-FITC免疫熒光顯示創(chuàng)區(qū)表皮層，絕大部分細(xì)胞呈綠色的陽(yáng)性染色，抗人K19-FITC免疫熒光顯示僅有極個(gè)別基底層細(xì)胞呈綠色的陽(yáng)性染色。 研究結(jié)論：利用膠原酶消化法，以及添加KGF的條件培養(yǎng)基，采用分步接種法，可以在體外短期內(nèi)(約8天)構(gòu)建出足夠可用(約30倍于取材面積)的復(fù)合型組織工程化自體皮膚，這可能為