組織工程角膜的體外構建及移植的實驗研究.pdf

1、取少量健康的自體角膜組織，體外培養(yǎng)擴增后種植于一種生物相容性良好的載體上，形成結構和功能與在體角膜相似的組織工程角膜，移植到患眼，不但解決了角膜供體來源不足的問題而且不存在免疫排斥反應。組織工程化角膜以其低抗源性、來源不受限、可按預先設計塑型、具有生物活性等特征為臨床應用提供了廣闊的前景。本實驗制備豬去細胞角膜基質材料(PACM)，對此材料的生物相容性、活體內移植進行觀察；進一步研究在體外構建含細胞組織工程角膜基質的方法，并將構建的含細

2、胞組織工程角膜基質進行移植實驗。 一、豬去細胞角膜基質材料的制備及其生物相容性 檢測用三種不同的方法制備豬去細胞角膜基質材料，以找到一種較理想的制備方法和支架材料：以豬角膜為材料來源，分別用Triton(曲拉通)聯(lián)合0.25％胰酶、Triton聯(lián)合DNA-RNA酶、Triton聯(lián)合0.25％胰酶及DNA-RNA酶消化去細胞，進HE染色、掃描電鏡觀察；在材料上接種兔角膜基質細胞，進行HE染色觀察。 結果：Trito

3、n聯(lián)合0.25％胰酶、DNA-RNA酶消化去細胞方法最佳，時間為4h。經HE染色、掃描電鏡觀察證實：此方法制備的PACM細胞去除完全，呈三維立體網格狀結構，網狀間隙明顯增大，平均為200um左右。兔角膜基質細胞接種在PACM上后12h開始伸展并緊密貼附，細胞狀態(tài)良好，4～5d鋪滿直徑6mm的材料表面。而另外兩種方法制備的PACM細胞去除不完全，網狀間隙無明顯增大，接種兔角膜基質細胞后，細胞不能很好的伸展，3～4d死亡。 分別將P

4、ACM和豬新鮮角膜基質植入兔皮下，1～8w時間內分別取材用HE染色觀察；再將PACM植入兔角膜基質囊袋內，用裂隙燈、HE染色觀察。結果：PACM植入兔皮下，僅在4w時發(fā)生短暫的炎癥反應，未見明顯的免疫排斥；而新鮮豬角膜基質1～8w時間內炎癥反應持續(xù)存在，發(fā)生了免疫排斥。PACM植入兔角膜基質囊袋中觀察：無明顯的免疫排斥反應發(fā)生，8w時PACM開始逐漸變薄，有透明趨勢。最長觀察到10m，PACM在角膜基質內幾乎完全透明。故PACM具有良好

5、的生物相容性。 二、豬去細胞角膜基質材料(PACM)的動物體內移植實驗 1.PACM對角膜重度堿燒傷進行移植分別采用PACM和甘油保存的兔板層角膜對兔角膜重度堿燒傷進行角膜移植治療。術后用裂隙燈、HE染色觀察。PACM移植早期(≤3w)有炎癥反應，但較非手術治療組炎癥反應輕，僅局限于角膜板層，未侵及角膜全層。6w，炎癥基本靜止，眼表恢復接近正常。觀察長達10m，術眼一直處于相對安靜狀態(tài)，角膜半透明或基本透明。HE染色：術

6、后6～7w，PACM周圍的炎細胞浸潤已明顯減輕，新生血管明顯減少，角膜基質纖維排列較早期規(guī)則并有角膜基質細胞開始向PACM周邊長入。術后11w，可見PACM與兔角膜基質融合良好，其間無明顯炎癥細胞浸潤，并有角膜基質細胞長入。故PACM可以有效的阻止堿燒傷后的炎癥反應，修復角膜損傷，防止了進一步的角膜潰瘍、穿孔的發(fā)生，恢復了眼表相對正常的結構，達到了臨床治愈標準。其療效與甘油保存的兔角膜相同。 2.PACM對細菌性角膜潰瘍進行移植

7、分別采用PACM和甘油保存的兔板層角膜對兔細菌性角膜潰瘍進行移植。術后進行裂隙燈、HE染色觀察。PACM移植術后2～3w，角膜上皮開始修復，角膜緣有新生血管侵入植片邊緣。4～5w，植片新生血管、水腫開始減退。6w，角膜植片新生血管明顯減少，水腫消失，整個角膜上皮完全修復，植片局部開始透明。8～10w，角膜植片已無明顯的新生血管浸潤，基本透明。組織學證實：術后8w，PACM周圍無炎細胞浸潤，與角膜基質組織融合生長良好。觀察長達10m，PA

8、CM基本完全與角膜基質組織融合，改建為正常兔角膜基質組織，再生的膠原纖維排列規(guī)則、緊密。故PACM可修復角膜潰瘍并改建透明。 三、含細胞組織工程角膜基質的體外構建及動物移植實驗 利用組織工程技術體外構建角膜基質層：以兔角膜基質作為細胞來源，用消化法獲得兔角膜基質細胞并用PKH26進行熒光標記，將其接種在PACM上，構建出含細胞組織工程角膜基質。用所構建的含細胞組織工程角膜基質修復細菌性角膜潰瘍。術后進行裂隙燈、HE染色、