新型組織工程角膜支架材料的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、正常角膜構(gòu)成眼球的第一道屏障，完成70％以上的屈光功能，對(duì)視覺的形成極其重要。角膜病患病率高，致盲性強(qiáng)，僅次于白內(nèi)障居世界致盲原因的第二位。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，每年約1000萬世界人口因角膜病而致盲。同種異體角膜移植是治療角膜盲患者最有效的方法，但角膜供體來源匱乏使其應(yīng)用受到限制，角膜供體老齡化及激光手術(shù)的開展則使這種情況進(jìn)一步加劇。積極尋找新的角膜供體代替同種異體角膜是眼科界亟待解決的問題。 應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建角膜旨在為角膜病的治

2、療提供較好的材料來源，是目前全球眼科界研究的熱點(diǎn)。而選擇合適的支架材料則是構(gòu)建組織工程角膜的瓶頸。本研究應(yīng)用不同的理化方法脫細(xì)胞處理異種(豬)角膜，選擇脫細(xì)胞效果徹底且能完整保留組織結(jié)構(gòu)的標(biāo)本行組織學(xué)(光鏡/電鏡/免疫組化)、生物化學(xué)、生物力學(xué)等檢測(cè)以篩選制備異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的最佳方案，繼之通過生物相容性及生物安全性的檢測(cè)驗(yàn)證其作為組織工程角膜載體材料的可行性，初步行細(xì)胞接種為組織工程角膜的三維構(gòu)建提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

3、 第一部分:異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備 目的： 比較不同理化方法對(duì)異種角膜的脫細(xì)胞效果；篩選制備異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的最佳方法并檢測(cè)其生物學(xué)性能，為組織工程化人工角膜的構(gòu)建提供理想的載體材料。 方法： 1.應(yīng)用不同的去污劑及反復(fù)凍融法對(duì)豬角膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理：(1)0.25％、0.5％、1％、2％、5％Triton X-100各自分別處理12h、24h、36h、48h、72h、96h；(2)0.1％、0.25

4、％、0.5％、1％SDS；(3)0.25％、0.5％、1％SDS；(4)0.5％、1％CHAPS；(2)(3)(4)組各濃度分別處理12h、24h、36h、48h；(5)反復(fù)凍融：-80℃分別冷凍2h、24h、24h×3，室溫融化1h。通過大體形態(tài)、組織學(xué)檢查初步評(píng)價(jià)各種方法的脫細(xì)胞效果。選擇脫細(xì)胞效果徹底、組織學(xué)結(jié)構(gòu)完整的標(biāo)本進(jìn)行生物力學(xué)性能檢測(cè)，并以新鮮豬角膜作對(duì)照，篩選出生物力學(xué)性能良好的方法。 2.應(yīng)用1篩選的方案脫細(xì)胞

5、處理豬角膜，行組織學(xué)檢禽HE染色、特殊染色(VG染色、阿利新蘭染色)、免疫組化染色(FN、LN、Ⅰ型及Ⅳ型膠原、a-SMA、a-gal)進(jìn)一步檢測(cè)脫細(xì)胞的效果及角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分保留的程度，行掃描電鏡、透射電鏡檢查脫細(xì)胞角膜的超微結(jié)構(gòu)，并應(yīng)用生物化學(xué)的方法檢測(cè)脫細(xì)胞前、后角膜組織的含水量、羥脯氨酸含量、可溶性蛋白及DNA成分的變化。 結(jié)論： 0.5％及1％SDS處理24h均可完全脫除豬角膜的異種細(xì)胞成分并保留完整的組織結(jié)構(gòu)

6、，其他處理方法、濃度及時(shí)間均無此效果；0.5％SDS處理24h能完全去除豬角膜的異種細(xì)胞及其抗原成分，同時(shí)保留完整的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)、有效的生化成分及良好的機(jī)械力學(xué)性能，因而是制備異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的最佳方法。 第二部分:異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)生物相容性及生物安全性的研究 目的： 評(píng)價(jià)異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的生物相容性及生物安全性，為組織工程角膜支架材料臨床應(yīng)用的安全性提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.按照

7、醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)ISO10993和GB/T16886的標(biāo)準(zhǔn)和要求進(jìn)行體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)、急性全身毒性試驗(yàn)、熱源試驗(yàn)和體內(nèi)植入試驗(yàn)。(1)以普通細(xì)胞培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，DMSO為陽性對(duì)照，應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)浸提液對(duì)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)影響； (2)觀察異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)浸提液注入鼠尾靜脈24h、48h、72h后受試動(dòng)物的體重變化及生命體征變化； (3)測(cè)量異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)浸提液注入兔耳緣靜脈后的體溫變化； (4)

8、異種角膜基質(zhì)制備成直徑5mm、厚150μm的圓片狀，0.5％SDS處理24h并組織學(xué)檢查驗(yàn)證脫細(xì)胞效果后植入兔角膜板層囊袋內(nèi)。陽性對(duì)照組植入新鮮(未脫細(xì)胞)角膜基質(zhì)，空白對(duì)照組只制作囊袋。術(shù)后每天裂隙燈觀察并于術(shù)后2w、4w、8w、12w及24w取角膜行組織病理學(xué)檢查。 2.以PK15細(xì)胞為陽性對(duì)照，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)新鮮豬角膜、脫細(xì)胞豬角膜及兔角膜板層囊袋植入脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)4w、12w及24w的兔外周血中有無PERV基因的

9、表達(dá)。 結(jié)論： 異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)無細(xì)胞毒性、無急性全身毒性、無熱源性、植入體內(nèi)無毒性反應(yīng)并能促進(jìn)周圍角膜基質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)入，屬于無毒級(jí)生物材料并具有良好的生物相容性；0.5％SDS處理24h可以去除異種角膜基質(zhì)PERV的表達(dá)而具有一定的生物安全性；異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)是組織工程角膜構(gòu)建的理想載體材料。 第三部分:異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)為載體構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)層的實(shí)驗(yàn)研究 目的： 探討以異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)為載

10、體構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)層的可行性，觀察脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的體外再細(xì)胞化情況。 方法：采用組織塊培養(yǎng)的方法原代培養(yǎng)兔角膜上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并行免疫組化檢查鑒定細(xì)胞表型。分別采用細(xì)胞懸液及基質(zhì)注射的方式在脫細(xì)胞角膜基質(zhì)表面及內(nèi)部接種基質(zhì)細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并行組織學(xué)檢查。 結(jié)論： 組織塊原代培養(yǎng)的方法可以獲取保持正常細(xì)胞表型的3種角膜細(xì)胞；角膜基質(zhì)細(xì)胞與脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)共培養(yǎng)能保持正常的細(xì)胞活性與