新型多肽神經(jīng)組織工程支架材料及神經(jīng)干細(xì)胞在其表面生長分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：（1）建立小鼠乳鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法。 （2）鑒定神經(jīng)干細(xì)胞及分化后的細(xì)胞，為神經(jīng)干細(xì)胞的體內(nèi)移植研究奠定基礎(chǔ)。 方法：體外分離出新生SD小鼠（出生1-3天內(nèi)）的大腦皮質(zhì)，機(jī)械吹打，采用無血清懸浮培養(yǎng)法，采用DMEM/F12培養(yǎng)基，添加B27，bFGF和EGF等生長因子，調(diào)整細(xì)胞密度至1×107/L，1×108/L，1×109/L，1×1010/L進(jìn)行體外培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，取得具有自

2、我復(fù)制、增殖能力的細(xì)胞，并將細(xì)胞貼壁培養(yǎng)檢測(cè)其分化能力，應(yīng)用多克隆兔抗鼠巢蛋白（Nestin）、多克隆兔抗鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Neuron Specific Enolase NSE）、多克隆兔抗鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體，免疫組化鑒定細(xì)胞。 結(jié)果： （1）從新生小鼠大腦皮層組織分離出的細(xì)胞，在添加B27和EGF、bFGF的DMEM/F12的無血清

3、培養(yǎng)基中，可持續(xù)增殖，聚集成神經(jīng)球。細(xì)胞經(jīng)過貼壁后分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，此法較簡(jiǎn)單，為進(jìn)行NSCs體內(nèi)移植奠定了基礎(chǔ)。 （2）MTT實(shí)驗(yàn)顯示按1×109/L密度培養(yǎng)細(xì)胞增殖最快，細(xì)胞數(shù)量從第3天起迅速增殖，于第7天達(dá)高峰。 （3）免疫細(xì)胞化學(xué)法呈現(xiàn)：抗Nestin陽性、抗NSE陽性，抗GFAP陽性。 結(jié)論：按上述方法分離、培養(yǎng)出的細(xì)胞具有自我復(fù)制、增殖及分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的特性，屬于神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs

4、）。 目的：設(shè)計(jì)合成含IKVAV的新型組織工程多肽序列，研究其在不同條件下自組裝為多孔凝膠及生物力學(xué)特性。 方法：用傳統(tǒng)的固相法合成多肽（上海波泰生物科技有限公司），使用高效液相色譜儀（High performance liquid chromatograph，HPLC）測(cè)定純度，質(zhì)譜儀（Mass spectrometer，MS）測(cè)定分子量；將合成的多肽粉末溶于0.1mol/LNaOH溶液中，配成10，2，1，0.5％wt

5、肽溶液，各取200ul肽溶液，加入等體積的DMEM/F12，涂于蓋玻片或置于10mol/L鹽酸蒸汽中，置入37℃干燥箱。使用掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）及透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）檢測(cè)自組裝凝膠的結(jié)構(gòu)，凝膠的流變學(xué)特性則使用血流計(jì)來測(cè)定。 結(jié)果：MS示肽的分子量為1351.72，HPLC示其純度為95％。多肽在DMEM/F1

6、2觸發(fā)下，數(shù)秒內(nèi)形成凝膠；于10mol/L HCL蒸氣中，2小時(shí)后形成凝膠薄膜；在37℃恒溫干燥箱中，僅見白色肽粉末，未見凝膠；SEM檢測(cè)10％wt多肽自組裝凝膠由許多納米纖維構(gòu)成，呈現(xiàn)多孔厚壁結(jié)構(gòu)，TEM示：2，1，0.5％wt多肽自組裝凝膠是由相互交叉的編織狀納米纖維構(gòu)成。1％wt多肽凝膠纖維直徑有3.5～5nm，長度95nm～1500nm；2％wt多肽凝膠納米纖維十分密集；0.5％wt肽凝膠納米纖維十分細(xì)，纖維間有較大的空隙；時(shí)間

7、掃描流變學(xué)示：損耗模量呈線性比存儲(chǔ)模量小，證實(shí)自組裝凝膠有一定生物力學(xué)強(qiáng)度，可支撐接種的細(xì)胞。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成了新型組織工程多肽，在DMEM/F12中可自組裝成多孔凝膠，成功合成了一種含IKVAV等活性區(qū)域的新型脊髓組織工程支架材料。 目的：體外分離培養(yǎng)出NSCS，接種于組織工程多肽自組裝多孔凝膠的表面，觀察NSCS在二維凝膠表面及其血清，聯(lián)合因子等條件下生長、分化情況。 方法：取小鼠乳鼠的大腦皮質(zhì)，機(jī)械分離

8、，無血清懸浮培養(yǎng)出NSCS，用免疫細(xì)胞化學(xué)法，鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶（Streptavidin biotin peroxidase Complex，SABC）檢測(cè)試劑盒鑒定細(xì)胞。多肽溶于NaOH溶液中，濃度為1％wt，PH=9.0，加DMEM/F12在蓋玻片上觸發(fā)多肽自組裝為凝膠，TEM檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組：NSCS接種于二維凝膠的表面；對(duì)照組：NSCS接種于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的蓋玻片表面；倒置相差顯微鏡觀察NSCS生長及分化情況，免疫

9、細(xì)胞化學(xué)染色，激光共焦顯微鏡觀察。 將NSCS球接種于用預(yù)先涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，在NSCS球貼壁后，按以下分組進(jìn)行誘導(dǎo)分化：（1）5μ mol/ml Forskolin、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF200 ng/ml神經(jīng)基因調(diào)節(jié)劑（HRG），聯(lián)合因子組；（2）10％血清，血清組；（3）20ng/ml bFGF，bFGF組。各組的培養(yǎng)基均為為DMEM/F12+B27添加劑。 用MAP2陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)

10、分化的神經(jīng)元，Hoechst33342陽性標(biāo)記數(shù)來計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。NSCS的神經(jīng)元分化率=MAP2+細(xì)胞數(shù)/Hoechst33342標(biāo)記細(xì)胞數(shù)。用圖像分析軟件對(duì)采集圖像中MAP2陽性的神經(jīng)元的胞體面積、周長及細(xì)胞最長突起長度進(jìn)行分析。 結(jié)果：免疫組化鑒定：無血清懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCS，抗Nestin陽性。TEM示：凝膠為相互交織成網(wǎng)狀的納米纖維。實(shí)驗(yàn)組：7天后，IPCM觀察到NSCS長出細(xì)長突起，對(duì)照組僅見未分化狀態(tài)的NSCS球

11、。LCM觀察：實(shí)驗(yàn)組，NSCS發(fā)生分化，見神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞，NF陽性，為較強(qiáng)紅色熒光，GFAP陽性，為弱綠色熒光；對(duì)照組：只見NSCS球，Nestin陽性，為綠色熒光。 聯(lián)合因子組：免疫熒光顯示：MAP2陽性細(xì)胞沿著S100陽性細(xì)胞的突起向外周移行，生長，分化，到誘導(dǎo)10d后，MAP2陽性細(xì)胞也出現(xiàn)許多突起，有部分呈現(xiàn)TH免疫陽性。 血清組：免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色見細(xì)胞呈S100強(qiáng)陽性，Hoechst33342染色見細(xì)

12、胞核較大，MAP2陽性細(xì)胞數(shù)量較少，胞體飽滿。 bFGF組：免疫熒光檢測(cè)：誘導(dǎo)3～5d后逐漸呈S100陽性，突起粗短。 結(jié)論：本課題采用機(jī)械分離，無血清懸浮培養(yǎng)出NSCS。TEM證實(shí)凝膠為網(wǎng)狀納米纖維。使用免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行細(xì)胞鑒定：凝膠對(duì)NSCS有較好的細(xì)胞相容性，NSCS在其表面可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。證實(shí)多肽自組裝二維凝膠可作為一種神經(jīng)組織工程支架材料。NSCS在聯(lián)合因子和血清，bFGF條件下，生長分