在位內(nèi)膜生物學特性及候選基因RASSF2甲基化在子宮內(nèi)膜異位癥惡變中的作用.pdf

1、目的:
　　子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMs，簡稱內(nèi)異癥)是普通婦科領(lǐng)域最受關(guān)注的疾病，雖然內(nèi)異癥以生育年齡女性為高發(fā)人群，而且不孕、疼痛、盆腔包塊為主要臨床特點，但內(nèi)異癥惡變始終是內(nèi)異癥研究的熱點問題。內(nèi)異癥惡變率為0.7％～1.5％[1]。近年，內(nèi)異癥的發(fā)生率不斷增高，其惡變的病例數(shù)也在逐年增加。內(nèi)異癥惡變最多見于卵巢，占內(nèi)異癥惡變的76％，主要病理類型為內(nèi)膜樣癌和透明細胞癌。卵巢外的內(nèi)異癥惡變可見于腸道、盆

2、腔、陰道直腸膈、陰道及剖宮產(chǎn)瘢痕等處，病理類型以異位腺上皮細胞惡變?yōu)橄侔橹鱗2]。
　　子宮內(nèi)膜異位癥惡變系統(tǒng)科學研究的基礎(chǔ)研究條件成為阻礙研究進展的重要因素，細胞模型建立、動物模型建立報道都較罕見。轉(zhuǎn)基因誘發(fā)的靶向動物模型最具備研究價值，但前提是疾病的致病靶基因相對明確，內(nèi)異癥惡變靶基因研究尚為空白。而內(nèi)異癥惡變移植動物模型的建立因大樣本惡變標本及細胞模型的缺乏而難以實現(xiàn)，誘導內(nèi)異癥移植動物模型惡變存在異種排斥等干擾因素，結(jié)論

3、科學性受到質(zhì)疑。有效的誘導內(nèi)異癥惡變也許是突破研究障礙的重要途徑之一。
　　在內(nèi)異癥惡變臨床高危因素中，高雌激素居首，局部高雌激素刺激導致內(nèi)異癥異位內(nèi)膜過度生長，可能與內(nèi)異癥惡變相關(guān)[3,4]。此外，糖尿病與子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[5]。高血糖為快速增殖的癌細胞提供豐富的營養(yǎng)環(huán)境，使其比正常細胞具有更強的代謝和消耗葡萄糖的能力[6]，間接促進高雌激素對異位內(nèi)膜細胞的刺激作用。因此，高血糖可能成為內(nèi)異癥惡變的“催

4、化劑”，加速良性異位內(nèi)膜細胞惡變。手術(shù)誘導的大鼠自體內(nèi)異癥模型廣泛應用于基礎(chǔ)及臨床研究[7]。大鼠異位種植內(nèi)膜與人類內(nèi)異癥有很多相似之處:異位內(nèi)膜生長方式，雌激素敏感性，病灶及腹腔液中異常細胞因子表達，以及臨床表現(xiàn)，例如:不孕[8]和盆腔疼痛等[9]。因此，大鼠內(nèi)異癥自體模型適合作為誘導內(nèi)異癥惡變載體。
　　內(nèi)異癥惡變的發(fā)生和發(fā)展是一個多基因、多步驟的過程。近年來表觀遺傳學機制與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系是廣大學者研究的熱點，其中DNA

5、甲基化是表觀遺傳學上研究最深入的一種機制。DNA甲基化是指額外的甲基通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)，鏈接到CpG島中胞嘧啶5＇碳末端，CpG島發(fā)生異常甲基化常見于基因啟動子區(qū)域[10]?；騿幼訁^(qū)域甲基化是導致基因沉默的一種重要表觀遺傳機制[10,11]，能夠通過抑制基因表達進而使調(diào)節(jié)DNA修復、細胞周期、凋亡、細胞粘附和解毒等相關(guān)的細胞通路失活，使細胞無限增殖，最終導致腫瘤的發(fā)生[12，13]。RASSF2基因是本課題組通過甲基化CpG島

6、富集結(jié)合代表性差異分析(MCA-RDA)技術(shù)篩查出的卵巢內(nèi)異癥惡變組織相對正常卵巢組織的差異甲基化基因。RASSF2基因包含11個外顯子，定位于染色體20p13，跨度約43kb，具有3個轉(zhuǎn)錄本:RASSF2A、RASSF2B和RASSF2C，僅RASSF2A在轉(zhuǎn)錄起始部位-105bp到+1075bp間具有一個CpG島結(jié)構(gòu)。RASSF2蛋白并不具有酶活性或者DNA結(jié)合能力，但可以通過與其他凋亡前因子及腫瘤抑制因子相互作用激活，如:PAR-

7、4和MST1/2[14,15]。因此，RASSF2同時也可調(diào)節(jié)這些因子所控制的信號通路。研究表明，RASSF2基因過表達可促進凋亡及細胞周期阻滯，抑制腫瘤細胞生長[16]。相反，RASSF2表達缺失可導致細胞過度生長、惡變及腫瘤轉(zhuǎn)移[17-19]。因此，RASSF2基因被認為是一種抑癌基因。RASSF2甲基化見于多種類型腫瘤[20,21]。本課題組前期研究表明RASSF2基因的表觀失活與卵巢內(nèi)異癥惡變相關(guān)，參與了異位內(nèi)膜向卵巢癌的惡變過

8、程，可能是內(nèi)異癥惡變過程的晚期事件[22]。因此，RASSF2基因過甲基化與內(nèi)異癥惡變的更深入機制值得探討。
　　本研究在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上，通過甲基化寡核苷酸技術(shù)靶向誘導內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜細胞中RASSF2基因甲基化，研究RASSF2基因甲基化對子宮內(nèi)膜細胞的影響。利用技術(shù)成熟的大鼠內(nèi)異癥自體模型，通過鏈脲霉素與高糖高脂飲食共同誘導發(fā)生糖尿病，并給予高雌激素刺激，誘導大鼠內(nèi)異癥惡變，進一步明確RASSF2基因與內(nèi)異癥惡

9、變相關(guān)性。
　　方法:
　　一、高雌激素和高血糖誘導大鼠內(nèi)異癥自體模型惡變及其生物學特征研究
　　1、建立大鼠腹膜子宮內(nèi)膜異位癥模型;
　　2、高糖高脂飲食、鏈脲霉素及高雌激素誘導大鼠內(nèi)異癥惡變;
　　3、光鏡，電鏡觀察異位內(nèi)膜組織顯微及亞顯微結(jié)構(gòu);
　　4、免疫組化檢測大鼠異位及在位內(nèi)膜組織中PTEN、p-AKT和p-mTOR的表達情況;
　　5、增殖、凋亡檢測異位組織生物活性。
　　二

10、、在位子宮內(nèi)膜細胞RASSF2基因甲基化在子宮內(nèi)膜異位癥惡變中的作用及意義
　　1、原代培養(yǎng)內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細胞;
　　2、免疫細胞化學染色鑒定細胞;
　　3、建立RASSF2甲基化(methylated oligonucleotide，MON)及非甲基化(non-methylated oligonucleotide，NON)細胞模型;
　　4、甲基化特異性PCR(Methylation Specif

11、ic PCR，MSP)技術(shù)檢測RASSF2在細胞模型中的甲基化情況;
　　5、蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blotting)檢測RASSF2蛋白表達情況;
　　6、MTT細胞增殖實驗檢測轉(zhuǎn)染MON及NON后各組細胞增殖能力的改變;
　　7、應用Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒檢測RASSF2基因發(fā)生甲基化前后各組細胞凋亡率的改變;
　　8、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測RASSF2基

12、因發(fā)生甲基化前后MMP-9，VEGF在培養(yǎng)上清中的含量變化;
　　9、高雌激素及高血糖誘導大鼠內(nèi)異癥惡變;
　　10、甲基化特異性PCR(Methylation Specific PCR，MSP)技術(shù)檢測RASSF2在異位及在位組織中的甲基化情況;
　　11、蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blotting)檢測RASSF2在異位及在位組織中的蛋白表達情況。
　　結(jié)果:
　　一、高雌激素和高血糖誘導大鼠內(nèi)

13、異癥自體模型惡變及其生物學特征研究
　　1、90只實驗大鼠中有10只于術(shù)后死亡，占11.1％。實驗組與對照組異位病灶全部形成;
　　2、實驗組多數(shù)異位病灶隨時間延長逐漸增大，而對照組病灶萎縮情況隨時間延長明顯增加。實驗組在2、4、8個月異位病灶平均凈重及平均體積明顯高于相應月份對照組異位病灶(p＜0.05)。實驗組中，可見2例明顯增大的異位病灶，囊壁增厚，內(nèi)壁可見乳頭樣增生。其余異位病灶呈現(xiàn)囊性，伴有囊壁不同程度增厚，囊液不

14、同程度渾濁，可見血性或膿性囊液;
　　3、光鏡下，實驗組中，2例明顯增生的異位病灶表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜樣癌，其對應在位內(nèi)膜組織均為不典型增生改變(4.0％);3例異位病灶不典型性增生，對應在位內(nèi)膜組織均為單純增生樣改變(6.0％)。透射電鏡可見:惡變細胞呈現(xiàn)明顯細胞形態(tài)的異常，可見線粒體腫脹及空泡樣改變。此外，與4個月單純性增生相比，8個月單純性增生異位內(nèi)膜細胞呈現(xiàn)增大的細胞核，細胞質(zhì)減少，表現(xiàn)出更活躍的細胞狀態(tài);
　　4、在惡變

15、、不典型性增生在位及異位內(nèi)膜中，與對照組異位內(nèi)膜相比，p-AKT及p-mTOR染色H-score值逐漸增加，有統(tǒng)計學差異(p＜0.05); PTEN染色H-score值逐漸降低，有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。相同病理類型內(nèi)膜組織上述基因無統(tǒng)計學差異(p＞0.05);
　　5、增殖實驗顯示:實驗組中，與良性和不典型增生異位內(nèi)膜相比，惡變的異位內(nèi)膜增殖染色H-score值明顯增加(p＜0.05);凋亡實驗顯示:與良性和不典型增生異位內(nèi)

16、膜相比，惡變的異位內(nèi)膜凋亡染色H-score值明顯減少(p＜0.05)。雌激素組良性異位內(nèi)膜組織增殖染色H-score值高于對照組良性異位內(nèi)膜組織(p＜0.05);凋亡染色強度低于對照組良性異位內(nèi)膜組織(p＜0.05)。
　　二、誘導在位子宮內(nèi)膜細胞中RASSF2基因甲基化及其分子生物學研究
　　1、體外成功分離和共培養(yǎng)子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細胞(EC);
　　2、免疫細胞化學染色鑒定結(jié)果表明，角蛋白染色陽性

17、，CD10染色陰性，波形蛋白染色陰性，證實為子宮內(nèi)膜上皮細胞;角蛋白染色陰性，CD10染色陽性，波形蛋白染色陽性，證實為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞;
　　3、構(gòu)建兩個甲基化細胞模型（MON1組及MON2組），一個非甲基化細胞模型(NON組)，未轉(zhuǎn)染寡核苷酸的對照組（EC組）;
　　4、MSP結(jié)果顯示:MON1組及MON2組內(nèi)膜細胞均發(fā)生RASSF2基因甲基化，NON組未檢測到該基因發(fā)生甲基化;
　　5、蛋白免疫印跡結(jié)果顯示:MO

18、N1組及MON2組RASSF2蛋白表達水平均低于NON組，有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。MON1組及MON2組RASSF2蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)，NON組及EC組無差異(p＞0.05);
　　6、MTT細胞增殖實驗結(jié)果顯示:MON1組及MON2組在24h，48h和72h細胞增殖能力明顯高于相應NON組(p＜0.05)。其中，MON1及MON2組在72hEC增殖能力低于48h(p＜0.05)。NON組細胞增殖能力與

19、EC組無顯著統(tǒng)計學差異(p＞0.05);
　　7、凋亡檢測結(jié)果顯示:RASSF2發(fā)生甲基化后EC即轉(zhuǎn)染MON1及MON2后凋亡率明顯降低，與RASSF2未發(fā)生甲基化的NON組比較，p＜0.05。EC轉(zhuǎn)染NON組細胞凋亡率與EC組相比，差別無統(tǒng)計學意義，(p＞0.05);
　　8、酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染MON1后，EC分泌VEGF及MMP-9較轉(zhuǎn)染NON組明顯增加(p＜0.05)。轉(zhuǎn)染MON2后，EC分泌VEGF及MM

20、P-9較轉(zhuǎn)染NON組明顯增加(p＜0.05)。但MON1組及MON2組，EC分泌上述兩種蛋白無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。轉(zhuǎn)染NON組，EC分泌VEGF及MMP-9與EC組相比無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。
　　9、MSP檢測結(jié)果表明:惡變及不典型性增生異位內(nèi)膜中RASSF2甲基化發(fā)生率高于良性異位內(nèi)膜(p＜0.05)，惡變異位內(nèi)膜中該基因的甲基化發(fā)生率高于不典型性增生異位內(nèi)膜(p＜0.05)。異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜RASSF2甲基化

21、率無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。
　　10、Western blot結(jié)果顯示:惡變異位內(nèi)膜和不典型性增生異位內(nèi)膜RASSF2蛋白相對表達水平分別為低于對照組異位內(nèi)膜(p＜0.05)，惡變異位內(nèi)膜RASSF2蛋白相對表達水平低于不典型性增生異位內(nèi)膜(p＜0.05)。相同病理類型在位及異位組織RASSF2蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、本研究誘導大鼠內(nèi)異癥惡變可模擬人類低級別子宮內(nèi)膜樣腺癌，

22、方法簡單可行，并為進一步探討內(nèi)異癥惡變動物模型的建立，乃至為內(nèi)異癥惡變基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。同時發(fā)現(xiàn)在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜對誘導因素具有相似反應，發(fā)生一致性病理異常增值改變，其中異位內(nèi)膜更敏感、具有更高的惡變風險，提示在位內(nèi)膜惡變與異位內(nèi)膜惡變可能存在相似的遺傳相關(guān)性。
　　2、通過甲基化寡核苷酸技術(shù)特異性誘導內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細胞RASSF2基因甲基化，抑制該基因表達，導致內(nèi)膜細胞增殖、侵襲能力增強，并抑制細胞凋亡，RASSF2基因甲基化可