在位內(nèi)膜LncRNA BANCR表達與子宮內(nèi)膜異位癥惡變的相關(guān)性及作用機制研究.pdf

1、目的：子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMs，簡稱內(nèi)異癥）是婦科常見病和疑難病，雖然是良性疾病，卻有惡變傾向。子宮內(nèi)膜異位癥惡變率約1％左右。內(nèi)異癥惡變最高發(fā)部位在卵巢，其中約90％是上皮性惡性腫瘤。異位子宮內(nèi)膜發(fā)生惡變，生長旺盛的腫瘤組織破壞了起源組織，由于病理取材的局限，內(nèi)異癥惡變發(fā)病率可能被低估。根據(jù)內(nèi)異癥發(fā)病機制“在位內(nèi)膜決定論”和課題組前期內(nèi)異癥惡變系列研究，提出在位內(nèi)膜基因遺傳學改變與異位內(nèi)膜惡變同樣具有相關(guān)性。

2、因此，針對內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜惡變相關(guān)分子標志物進行風險評估，并給予早期干預、及時以預防惡變?yōu)槟康闹委焹?nèi)異癥，將對內(nèi)異癥惡變起到預防作用。長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA），不能編碼蛋白質(zhì)，長度大于200個核苷酸單位。研究報道lncRNA作為一種功能性RNA分子，其可從表觀遺傳學、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平等多方面調(diào)控基因表達，誘發(fā)腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展。前期已利用LncRNA/mRNA芯片對Ⅰ型內(nèi)膜癌癌組

3、織進行LncRNA表達譜篩查及組織驗證，LncRNA BANCR是其中明顯上調(diào)的LncRNA之一。而卵巢子宮內(nèi)膜異位癥惡變與子宮內(nèi)膜癌在臨床、病理特點及分子異常等方面存在顯著相關(guān)性，同時預實驗結(jié)果顯示LncRNA BANCR在內(nèi)異癥惡變癌組織中表達明顯升高，推測LncRNA BANCR可能同樣參與內(nèi)異癥惡變的發(fā)生。因此，本研究從在位內(nèi)膜LncRNA BANCR表達改變?nèi)胧?，通過組織和體外細胞實驗系統(tǒng)研究BANCR表達與子宮內(nèi)膜異位癥惡變

4、的相關(guān)性、生物學作用及可能調(diào)控機制，為實現(xiàn)利用內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜，預測異位內(nèi)膜惡變的風險提供新思路。
　　方法：利用顯微切割技術(shù)、石蠟組織提取RNA、實時定量PCR方法檢測LncRNA BANCR在內(nèi)異癥惡變中的表達情況，分析LncRNA BANCR與內(nèi)異癥惡變患者臨床病理特征的關(guān)系。體外細胞實驗中，利用子宮內(nèi)膜細胞原代培養(yǎng)、慢病毒感染、RNA干擾等技術(shù)構(gòu)建過BANCR表達及敲低細胞模型，利用CCK-8、細胞劃痕實驗、Transw

5、ell侵襲試驗及流式細胞技術(shù)等全面驗證BANCR對子宮內(nèi)膜細胞生物學行為的影響，明確在位內(nèi)膜BANCR改變在異位子宮內(nèi)膜發(fā)生惡變中的作用。利用生物信息學CNC共表達網(wǎng)絡(luò)分析BANCR的候選調(diào)控基因，利用免疫組化方法檢測候選調(diào)控基因在內(nèi)異癥惡變及其在位內(nèi)膜中的表達情況，分析BANCR表達與候選調(diào)控基因之間表達相關(guān)性。利用實時熒光定量PCR以及蛋白免疫印跡等技術(shù)分析BANCR對候選基因的調(diào)控關(guān)系，利用蛋白免疫印跡、CCK-8、劃痕和Tran

6、swell等技術(shù)檢測BANCR對ERK/MAPK信號通路激活的影響，明確BANCR參與內(nèi)異癥惡變的可能作用機制。
　　結(jié)果：⑴惡變癌組織LncRNA BANCR表達水平明顯高于其在位內(nèi)膜組織(P＜0.05);惡變癌組織BANCR表達水平明顯高于內(nèi)異癥組異位內(nèi)膜(P＜0.05)。在卵巢內(nèi)異癥組中，異位內(nèi)膜組織與其在位內(nèi)膜組織中BANCR表達水平之間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。BANCR在內(nèi)異癥惡變組的在位內(nèi)膜中表達水平顯著高

7、于內(nèi)異癥組在位內(nèi)膜（P＜0.05），也高于正常內(nèi)膜組織（P＜0.05）。在內(nèi)異癥惡變中，LncRNA BANCR表達水平與患者年齡及病理學類型無明顯相關(guān)性（P＞0.05），即卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌及卵巢透明細胞癌中BANCR表達水平無明顯差異。而LncRNA BANCR表達與內(nèi)異癥惡變患者FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，其中，BANCR在FIGOⅠ期與Ⅱ-Ⅳ期之間的表達差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.003)，同時，BANCR在FIGOⅠ a

8、期與Ⅰc期之間的表達差異也具有統(tǒng)計學意義(P=0.022)。體外細胞實驗中，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測結(jié)果顯示:感染BANCR過表達慢病毒的內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細胞(EUC-BANCR)中BANCR表達水平明顯高于陰性對照(NC)及空白對照(control)（P＜0.05），轉(zhuǎn)染si-BANCR組Ishikawa和HEC-1A細胞中BANCR表達水平均明顯減低(P＜0.05)，提示細胞轉(zhuǎn)染成功;CCK8檢測結(jié)果顯示:與空白對照及

9、陰性對照相比，過表達BANCR組內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細胞增殖能力明顯增高(P＜0.05)，敲低BANCR組Ishikawa和HEC-1A細胞增殖能力明顯減低（P＜0.05）;劃痕實驗結(jié)果顯示:過表達BANCR組內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細胞遷移能力明顯增高(P＜0.05)，敲低BANCR組Ishikawa和HEC-1A細胞遷移能力明顯減低（P＜0.05）;Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示:過表達BANCR組內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細胞侵襲能力明顯增高(P＜0.0

10、5)，敲低BANCR組Ishikawa和HEC-1A細胞侵襲能力明顯減低(P＜0.05);流式細胞儀分析結(jié)果顯示，過表達BANCR組內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細胞G0/G1期比例明顯減少，而S期比例明顯增加(P＜0.01)，敲低BANCR組Ishikawa和HEC-1A細胞G0/G1期比例明顯增加（P＜0.05），S期比例明顯減少（P＜0.05）;AnnexinⅤ/APC分析細胞凋亡結(jié)果顯示，過表達BANCR組內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細胞凋亡率明顯減低(P＜

11、0.01);蛋白免疫印跡技術(shù)檢測結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，過表達BANCR組，內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細胞中Cyclin D1、Bcl-2及Vimentin表達增高(P＜0.05)，E-cadherin減低（P＜0.05）。⑵對LncRNA BANCR進行生物信息學CNC(Coding-non-coding)共表達網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果提示MMP1、MMP2和PTK2/FAK可能與BANCR存在共表達關(guān)系(Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.9

12、9、0.988和0.987，P＜0.05）;免疫組化實驗結(jié)果顯示:卵巢內(nèi)異癥惡變組癌灶組織MMP2、MMP1及PTK2/FAK蛋白陽性率顯著高于其在位內(nèi)膜(P＜0.05)，同時，卵巢內(nèi)異癥惡變在位內(nèi)膜MMP2、MMP1及PTK2/FAK蛋白表達陽性率明顯高于內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組及正常內(nèi)膜組(P＜0.05);利用Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，BANCR表達與MMP2、 MMP1及PTK2/FAK陽性率成正相關(guān)(P＜0.01);熒光定量

13、PCR和蛋白免疫印跡實驗結(jié)果顯示，MMP2、MMP1及PTK2/FAK mRNA和蛋白水平在過表達BANCR的內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細胞(EUC-BANCR)中明顯增高（P＜0.05）;與空白對照組和陰性對照組相比，過表達BANCR的內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細胞中，P-ERK/ERK和P-ATK/AKT比值明顯增高(P＜0.05)，而ERK和AKT表達不改變，其中P-ERK蛋白表達水平差異更顯著，提示BANCR激活ERK/MAPK通路更為顯著;加入ERK

14、特異性抑制劑U0126后，P-ERK水平顯著減低，與單獨過表達BANCR相比，同時加入U0126的內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細胞增殖和遷移侵襲能力明顯減低（P＜0.01），同時可逆轉(zhuǎn)BANCR對MMP1和MMP2的上調(diào)作用，提示BANCR可通過激活ERK/MAPK通路進而影響內(nèi)膜細胞生物學特性，促進異位內(nèi)膜惡變的發(fā)生發(fā)展。
　　結(jié)論：①LncRNA BANCR在卵巢內(nèi)異癥惡變癌組織及其在位內(nèi)膜中高表達，LncRNA BANCR表達與卵巢內(nèi)異癥

15、惡變患者FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，在位內(nèi)膜LncRNA BANCR表達與卵巢子宮內(nèi)膜異位癥惡變的發(fā)生及疾病進展密切相關(guān)。LncRNA BANCR可能通過上調(diào)Cyclin D1、Bcl-2表達促進在位內(nèi)膜增殖抑制凋亡;BANCR可能通過上調(diào)Vimentin、下調(diào)E-cadherin促進EMT發(fā)生增強在位內(nèi)膜細胞遷移侵襲能力;LncRNA BANCR可通過影響內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜細胞增殖凋亡和遷移侵襲等生物學特性，參與內(nèi)異癥惡變的發(fā)生