子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜上調(diào)表達(dá)基因篩查及MAT2A基因功能鑒定.pdf

1、目的：
　　 子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥,Endometriosis,EMs)是育齡期婦女的常見病與多發(fā)病,具有浸潤、轉(zhuǎn)移及侵襲等惡性腫瘤的特征。迄今為止其發(fā)病機(jī)制仍未闡明。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制,經(jīng)血逆流學(xué)說是目前最被廣為接受的理論。但該理論不能解釋經(jīng)血逆流的發(fā)生率有80%-90%,而內(nèi)異癥的發(fā)生率只有10%-15%。大量研究結(jié)果顯示,內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜與j下常子宮內(nèi)膜在增殖、侵襲及凋亡等生物學(xué)特性方面存在差異。內(nèi)異癥在位內(nèi)膜基因表達(dá)的異

2、常改變可能是內(nèi)異癥在位內(nèi)膜生物學(xué)特性發(fā)生改變的基礎(chǔ),這些改變可能直接影響子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過程。內(nèi)異癥在位內(nèi)膜候選基因的基礎(chǔ)研究,其重要臨床意義不僅在于能進(jìn)一步闡述內(nèi)異癥發(fā)生機(jī)理,還能為臨床診斷途徑的突破、靶基因干預(yù)治療的實(shí)現(xiàn)奠定理論基礎(chǔ)。
　　 cDNA代表性差異分析法(cDNArepresentationaldifferenceanalysis,eDNA-RDA)是Hubank等在RDA和mRNA差異顯示兩種方法基礎(chǔ)上創(chuàng)立

3、的一種基因克隆方法,己廣泛應(yīng)用于差異基因表達(dá)譜的篩查和新基因的克隆。本課題組旨在通過cDNA代表性差異分析技術(shù)篩查內(nèi)異癥在位內(nèi)膜上調(diào)表達(dá)基因,尋找與內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的候選基因。選取篩查獲得的內(nèi)異癥在位內(nèi)膜上調(diào)表達(dá)基因之一,應(yīng)用Real-timePCR技術(shù)擴(kuò)大樣本進(jìn)一步檢測該基因在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜及對照組子宮內(nèi)膜中的表達(dá),初步驗證篩查結(jié)果可靠性的同時,探討該基因在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2A(

4、methionineadenosyl-transferase,MAT2A)是前期通過cDNA代表性差異分析技術(shù)篩查獲得的克隆重復(fù)次數(shù)最高的候選基因。目前,MAT2A基因與內(nèi)異癥相關(guān)研究尚未見報道。MAT是生物體內(nèi)合成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的關(guān)鍵酶,而SAM是甲基供體和多胺合成的前體,在所有細(xì)胞的體內(nèi)代謝中發(fā)揮核心作用。哺乳動物組織中,存在兩種不同的基因MAT1A和MAT2A,分別編碼兩個同源

5、性MAT催化亞單位α1(形成二聚體的MATⅢ或四聚體的MATⅠ)和α2(形成MATⅡ)。另外還存在MAT2B,編碼調(diào)節(jié)亞單位β,主要功能是抑制MATⅡ的活性。MAT1A僅在成人肝組織中表達(dá),MAT2A在所有非肝組織中均表達(dá)。研究表明,MAT2A不僅是有絲分裂原活性細(xì)胞因子如肝細(xì)胞生長因子、瘦素等誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的重要靶點(diǎn),而且能通過誘導(dǎo)FasL表達(dá),最終上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3水平,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MAT2A基因表達(dá)上調(diào)促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制

6、細(xì)胞凋亡,目前報道表明與肝癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、前列腺癌等許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。內(nèi)異癥雖為良性疾病,卻具有增殖、侵襲、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等類似惡性腫瘤的生物學(xué)特性。那么與細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)特性密切相關(guān)的MAT2A基因是否也參與內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制呢?MAT2A在內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著什么角色?本研究在國內(nèi)外首次探討MAT2A在內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法：
　　 一、應(yīng)用cDNA代表性差異分析技術(shù)篩查子宮內(nèi)膜異

7、位癥在位內(nèi)膜上調(diào)表達(dá)基因
　　 (一)提取內(nèi)異癥在位內(nèi)膜及對照組子宮內(nèi)膜組織樣本總RNA,分光光度計檢測總RNA純度及濃度,瓊脂糖電泳驗證RNA完整性。
　　 (二)DNA酶去除總RAN中殘留的基因組DNA,消除基因組的污染。
　　 (三)分離內(nèi)異癥在位內(nèi)膜及對照組子宮內(nèi)膜組織總RAN中的mRNA,去除rRNA的污染,分光光度計檢測mRNA純度及濃度,瓊脂糖電泳驗證mRNA提取質(zhì)量。
　　 (四)分別以內(nèi)

8、異癥在位內(nèi)膜組織mRNA及對照組子宮內(nèi)膜組織mRNA作為模板合成雙鏈cDNA。
　　 (五)內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜作為實(shí)驗組(Tester組),無內(nèi)異癥患者子宮內(nèi)膜作為對照組(Driver組),逐級提高Driver組比例進(jìn)行2輪消減雜交,獲得內(nèi)異癥在位內(nèi)膜中表達(dá)上調(diào)的差異基因片段。
　　 (六)克隆差異基因片段、菌粒PCR鑒定、測序并同源性分析。
　　 (七)選取篩查獲得的COX-2基因,Real-timePCR檢測

9、內(nèi)異癥在位內(nèi)膜及對照組子宮內(nèi)膜組織中COX-2mRNA的表達(dá),初步驗證篩查結(jié)果的可靠性。同時選取克隆重復(fù)次數(shù)最高,目前報道生物學(xué)特性與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病密切相關(guān)的MAT2A基因進(jìn)行后續(xù)深入研究。
　　 二、MAT2A基因在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制中的作用研究
　　 (一)RealTimePCR、Westernblot及免疫組化技術(shù)分別檢測內(nèi)異癥在位內(nèi)膜與對照組子宮內(nèi)膜組織中MAT2AmRNA及蛋白表達(dá)。
　　 (二

10、)原代培養(yǎng)內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ESC)及對照組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(NSC),免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定細(xì)胞。同時構(gòu)建3個MAT2AshRNA表達(dá)載體pGC-MAT2A-s1、pGC-MAT2A-s2和pGC-MAT2A-s3轉(zhuǎn)染ESC;構(gòu)建pEGFP-C1-MAT2A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSC。
　　 (三)RealTimePCR及Westernblot技術(shù)分別檢測ESC中MAT2A基因RNA干擾效果及NSC在轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-MAT2

11、A重組質(zhì)粒后MAT2A表達(dá)水平。
　　 (四)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗檢測MAT2A表達(dá)改變前后細(xì)胞增殖能力的變化。
　　 (五)Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗檢測MAT2A表達(dá)改變前后細(xì)胞侵襲能力的改變。
　　 (六)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測MAT2A表達(dá)改變前后細(xì)胞內(nèi)SAM、Caspase-3水平變化。
　　 (七)透射電鏡(TEM)觀察MAT2A表達(dá)改變前后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　 結(jié)果：

12、>　　 一、cDNA代表性差異分析法篩查獲得內(nèi)異癥在位內(nèi)膜上調(diào)表達(dá)基因10個
　　 隨著消減雜交輪數(shù)的增加,所獲得的差異片段數(shù)目減少,特異性擴(kuò)增信號不斷增強(qiáng),第二輪雜交后,1.5%瓊脂糖電泳可見條帶集中分布于100-500bp之間。克隆差異片段送測序,177個EST序列測序成功,GenBank中進(jìn)行同源性比對,其中有8個(4.52%)EST序列在數(shù)據(jù)庫中未找到匹配基因和蛋白,余169個EST序列比對篩查獲得Ems在位內(nèi)膜上調(diào)表

13、達(dá)基因lO個。其中已報道與Ems相關(guān)基因4個:COX-2、CFLI、BRAF、NRAS;EMs以外疾病相關(guān)基因4個:MAT2A、SEPT9、ATAD3A、CADM2;目前所有疾病中未見報道,功能未知基因2個:NAA15、CCDC21。選取COX-2基因,應(yīng)用RealTimePCR技術(shù)驗證篩查結(jié)果表明,EMs在位內(nèi)膜組COX-2mRNA水平顯著高于對照子宮內(nèi)膜組,與篩查結(jié)果一致。
　　 二、MAT2A基因在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制中

14、的作用研究
　　 (一)內(nèi)異癥在位內(nèi)膜和對照組子宮內(nèi)膜組織中MAT2A基因表達(dá)
　　 1.RealTimePCR結(jié)果表明,內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組MAT2AmRNA相對表達(dá)水平為3.20±2.05,顯著高于對照組子宮內(nèi)膜1.23±0.97。
　　 2.Westernblot結(jié)果表明,內(nèi)異癥在位內(nèi)膜MAT2A蛋白表達(dá)(0.63±0.43)高于對照組子宮內(nèi)膜(0.20±0.08)。
　　 3.免疫組化結(jié)果表明,MAT

15、2A在子宮內(nèi)膜組織的腺體和間質(zhì)細(xì)胞均表達(dá),內(nèi)異癥在位內(nèi)膜MAT2A蛋白表達(dá)(MOD:0.26±0.13)高于對照組子宮內(nèi)膜(MOD:0.19±0.12)。
　　 (二)MAT2A對子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜及對照組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)活性的影響
　　 1.RealTimePCR結(jié)果及Westernblot結(jié)果表明,ESC組MAT2AmRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于NSC組。pRC-MAT2A-s1、pRC-MAT2A-s2和

16、pRC-MAT2A-s3組MAT2AmRNA及蛋白表達(dá)水平分別與ESC組比較明顯降低,其中pRT-MAT2A-s3組MAT2AmRNA及蛋白表達(dá)水平最低。ESC轉(zhuǎn)染pRC-V質(zhì)粒組MAT2AmRNA及蛋白表達(dá)水平與ESC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。NSC轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-MAT2A質(zhì)粒組MAT2AmRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于NSC組。NSC轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-V質(zhì)粒組MAT2AmRNA及蛋白表達(dá)水平與NSC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。<

17、br>　　 2.CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗表明,從轉(zhuǎn)染pGC-MAT2A-s3表達(dá)載體48h開始,ESC增殖率明顯受到抑制,轉(zhuǎn)染pRC-V對照質(zhì)粒后ESC增殖率無明顯變化;而NSC在轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-MAT2A質(zhì)粒48h開始,增殖率顯著上調(diào);轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-V質(zhì)粒后NSC增殖率無明顯變化。
　　 3.細(xì)胞侵襲實(shí)驗結(jié)果顯示,ESC侵襲力顯著高于NSC:轉(zhuǎn)染pGC-MAT2A-s3表達(dá)載體后ESC侵襲力顯著下降,轉(zhuǎn)染pRC.

18、V對照質(zhì)粒的ESC侵襲力無顯著變化;NSC在轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-MAT2A質(zhì)粒后侵襲力顯著提高,轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-V質(zhì)粒后NSC侵襲力無明顯變化。
　　 4.酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果表明,ESC組細(xì)胞內(nèi)SAM水平高于NSC組,Caspase-3水平低于NSC組。ESC沉默MAT2A組(pRC-MAT2A-s3)與ESC組比較,細(xì)胞內(nèi)SAM水平降低,Caspase-3水平升高。ESC轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與ESC組比較細(xì)胞內(nèi)SAM、Cas

19、pase-3水平?jīng)]有改變,P＞0.05。NSC轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-MAT2A質(zhì)粒組與NSC組比較,細(xì)胞內(nèi)SAM水平升高,Caspase-3水平降低。NSC轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與NSC組比較細(xì)胞內(nèi)SAM、Caspase-3水平?jīng)]有改變。
　　 5.透射電鏡實(shí)驗表明,雖然ESC組細(xì)胞核型較規(guī)則,ESC轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組部分細(xì)胞核形狀不規(guī)則,兩組細(xì)胞均沒有明顯觀察到染色質(zhì)凝聚邊集。沉默MAT2A表達(dá)后,ESC細(xì)胞內(nèi)明顯可見異染色質(zhì)凝聚邊集,呈現(xiàn)凋

20、亡特征。NSC及NSC轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞核不規(guī)則,可觀察到部分染色質(zhì)邊集發(fā)生,呈現(xiàn)早中期凋亡特征;上調(diào)MAT2A表達(dá)后,NSC細(xì)胞核型較規(guī)則,異染色質(zhì)邊集少見,凋亡能力降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.利用cDNA代表性差異分析技術(shù)成功鑒定內(nèi)異癥在位內(nèi)膜上調(diào)表達(dá)基因,這些基因或參與新生血管形成,或與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),或與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān),或與細(xì)胞粘附、侵襲相關(guān),可能通過影響子宮內(nèi)膜的生物學(xué)特性,在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)

21、展中發(fā)揮著重要的作用。COX-2是篩查獲得的內(nèi)異癥在位內(nèi)膜上調(diào)表達(dá)基因之一,本研究通過RealTimePCR實(shí)驗進(jìn)一步驗證表明,內(nèi)異癥組在位內(nèi)膜COX-2mRNA表達(dá)顯著高于對照組子宮內(nèi)膜。COX-2基因異常表達(dá)可能在內(nèi)異癥的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。
　　 2.MAT2A基因是篩查獲得的克隆重復(fù)次數(shù)最高的內(nèi)異癥在位內(nèi)膜上調(diào)表達(dá)基因,進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗證表明MAT2A在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組織中的表達(dá)顯著高于對照組內(nèi)膜組織。體外實(shí)驗研