遺傳性纖維蛋白原缺陷癥的分子發(fā)病機制研究和血友病A植入前診斷的臨床前研究.pdf

1、遺傳性凝血因子缺陷癥是一類單基因遺傳病，雖發(fā)病率較低，但給患者本人及其后代帶來極大危害。對遺傳性凝血因子缺陷癥進行分子機制研究和產(chǎn)前診斷研究，不僅為探索凝血因子結(jié)構(gòu)與功能的關系提供了非常有價值的線索，且對降低此類遺傳病的發(fā)病率有重要意義。本文對4個遺傳性無纖維蛋白原血癥家系和1個遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系進行了表型診斷和分子機制研究，并對血友病A開展了植入前診斷的臨床前研究。 纖維蛋白原(fobrinogen，F(xiàn)g)是由AO、

2、Bp、γ三條多肽鏈組成的對稱性二聚體，三條多肽鏈分別由三個獨立的基因FGA、FGB、FGG編碼，F(xiàn)g在凝血的共同途徑中發(fā)揮重要作用。遺傳性無纖維蛋白原血癥(inherited afibrinogenemia)是一種常染色體隱性遺傳性疾病，發(fā)病率約為一百萬分之一。本文研究的4個遺傳性無纖維蛋白原血癥家系中，共有5例患者，年齡在8～22歲，皆有外傷后出血不止的表現(xiàn)，3例有臍帶出血史，3例有顱內(nèi)出血史，1例有內(nèi)臟出血史，1例出現(xiàn)大腿巨大皮下血

3、腫，他們的家系成員均無出血史。1個家系有近親婚史。所有患者APTT、PT和TT均極度延長甚至血漿不凝，F(xiàn)g的Clauss法和免疫比濁法結(jié)果為缺如或極度減低。在5例患者中共發(fā)現(xiàn)6個導致無纖維蛋白原血癥的Fg基因突變：3個FGA突變g.1892-1899delAGTA/GTAA、g.1978-3215dell238bp和g.3852C>T(Gln203X)及3個FGB突變g.2813C>T(Arg47X)、g.6668G>A(Gly377A

4、rg)和 g.6193G>A(Gly288Ser)。其中FGA g.3 852C>T(Gln203X)和 FGB g.6193G>A(Gly288Ser)為國際首次報道的突變，余為國內(nèi)首次報道的突變。 Bβ鏈Gly288Ser和Bp鏈Gly377Arg系錯義突變，在102例正常人對照中沒有被發(fā)現(xiàn)，初步排除了其為多態(tài)性的可能。多重序列保守性比對示這兩個位點有高度的保守性；Fg晶體結(jié)構(gòu)預測發(fā)生這2個錯義突變后可將極性側(cè)鏈結(jié)構(gòu)引入疏

5、水核，導致蛋白質(zhì)不能正確折疊，最終產(chǎn)生Fg裝配和/或分泌缺陷。體外表達研究顯示：Bp鏈GIy288Ser和Bβ鏈Gly377Arg皆不引起轉(zhuǎn)錄水平的降低，主要在蛋白質(zhì)水平引起細胞內(nèi)滯留導致Fg分泌障礙，其在細胞內(nèi)滯留的部位可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或其它pre-Golgi體結(jié)構(gòu)，突變Fg還存在部分細胞內(nèi)降解，蛋白酶體降解途徑在這兩種突變體的降解機制中起重要作用。 遺傳性異常纖維蛋白原血癥(inherited dysfibrinogenemia

6、)多以常染色體顯性或共顯性方式遺傳，患者多無癥狀，少數(shù)有出血表現(xiàn)或血栓形成或血栓伴輕度出血的表現(xiàn)。本研究中1個遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的先證者雖無癥狀，但實驗室檢查示APTT、PT正常，TT超出正常對照上限值2倍以上且不能被甲苯胺藍糾正；Fg含量C1auss法明顯降低，免疫比濁法低于參考范圍，且用Clauss法測得Fg含量顯著低于免疫比濁法；還原的SDS-PAGE示先證者γ鏈的條帶較正常對照弱。其家系成員均無癥狀，但先證者母親實驗室

7、表型的檢測結(jié)果與先證者相似，余成員所測指標皆正常。該家系基因分析示：先證者為γ鏈Arg275His錯義突變，此突變來源于母系。經(jīng)文獻檢索，該錯義突變是γ鏈的突變熱點，主要通過影響纖維蛋白單體聚合導致異常纖維蛋白原血癥。該家系為國內(nèi)首次進行基因診斷的遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系，1，鏈Arg275His也為國內(nèi)首次報道的突變。 植入前診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)是輔助生殖技術

8、與遺傳學技術相結(jié)合的一種孕前診斷技術。由于模板量少且要求在48小時內(nèi)對標本做出診斷，故基因分析是PGD中最難的部分。本研究中選擇了6個與FVШ基因緊密連鎖的STR位點，即DXSl5、DXS9901、G6PD、DXSl073、DXSll08和F8Civsl3建立多重巢式熒光PCR方法，在118例正常人及12個血友病A家系中進行了信息量和診斷率的檢測，發(fā)現(xiàn)了4個STR位點(DXSl5、DXS9901、DXSl073和F8Civsl3)的期望

9、雜合度、觀察雜合度和診斷率都超過50％，所有血友病A家系的診斷結(jié)果都與以前診斷結(jié)果相符，且未發(fā)現(xiàn)重組現(xiàn)象。選擇了3個雜合度及診斷率較高的STR位點(F8Civsl3、DXSl073和DXSl5)聯(lián)合性別位點Amelogenin在單淋巴細胞和單卵裂球水平上建立了四重巢式熒光PCR方法，其擴增成功率、ADO率、假陽性率和假陰性率等都與國內(nèi)外的報道相符。本研究建立的單細胞四重巢式熒光PCR方法快速有效，為臨床血友病A植入前診斷打下扎實的實驗基