蛋白激酶C-β-銜接蛋白氧化應(yīng)激通路介導(dǎo)早產(chǎn)兒氧暴露后體內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生的研究.pdf

1、目的:研究早產(chǎn)兒氧暴露后體內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生可能的線粒體氧化應(yīng)激信號傳導(dǎo)途徑。
　　方法:隨機選擇2012年7月至2012年12月胎齡為34周以下四川醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院新生兒科住院但未用氧治療的早產(chǎn)兒20例作為對照組，未發(fā)生呼吸窘迫綜合征(respiratory distress syndrome，RDS)及呼吸衰竭，脈搏血氧飽和度(SpO2)＞85％，暴露于空氣中時間＞48h，住院主要原因為早產(chǎn)兒。并隨機選擇相同時間段置于同一室住院診

2、斷為呼吸衰竭[Ⅰ型呼衰:動脈血氧分壓(PaO2)＜6.67kPa;Ⅱ型呼衰:PaO2＜6.67kPa，動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)＞6.67kPa]需給氧支持治療的胎齡34周以下的早產(chǎn)兒20例作為高體積分?jǐn)?shù)氧（高氧）組(吸氧體積分?jǐn)?shù)＞400mL/L，吸氧時間48.00～69.00h)，住院主要原因為均患有不同程度的RDS合并呼衰。兩組患兒入院時間為出生后0.25～10.00h。并排除患有以下疾病者:(1)ABO溶血和葡萄糖-6-磷酸

3、脫氫酶(G6PD)缺陷;(2)先天性心臟病;(3)驚厥、顱內(nèi)及消化道出血者;(4)感染。經(jīng)四川醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會授權(quán)并取得家屬知情同意后，兩組早產(chǎn)兒在入院后72h經(jīng)橈動脈無菌下采血2mL置肝素抗凝管中，取新鮮抗凝血2mL與Hank's液1∶1混勻后，用吸管吸取新鮮稀釋血液沿離心管壁緩緩加到淋巴細(xì)胞分離液液面上，并水平離心后提取環(huán)狀乳白色層即外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mono-nuclear cell，P

4、BMC)滴于蓋玻片上，加入40 g/L多聚甲醛使之固定于蓋玻片上，用免疫組織化學(xué)方法（PV法）檢測高氧組和對照組中PBMC內(nèi)蛋白激酶C-β(PKCβ)、銜接蛋白(p66Shc)、脯氨酰異構(gòu)酶(Pin1)和胞質(zhì)磷酸化p66Shc-Ser36蛋白的表達，在倒置相差顯微鏡下觀察，陽性著色為黃色或棕黃色顆粒。用熒光顯微鏡技術(shù)檢測線粒體活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，陽性顯色為紅色熒光。
　　結(jié)果:1

5、.對照組與高氧組早產(chǎn)兒PKCβ蛋白表達情況:陽性表達染色為金黃色和黃褐色位于胞質(zhì)，與對照組相比，高氧組細(xì)胞內(nèi)PKCβ的表達明顯增加，差異有顯著性（t=21.139，P＜0.001）;2.對照組與高氧組早產(chǎn)兒p66Shc蛋白表達情況:陽性表達染色為金黃色和黃褐色大部分位于胞質(zhì)。與對照組相比，高氧組細(xì)胞內(nèi)p66Shc的表達明顯增加，差異有顯著性(t=5.592，P＜0.001);3.對照組與高氧組早產(chǎn)兒 Pin1蛋白表達情況:陽性表達染色為

6、金黃色和黃褐色位于胞質(zhì)或胞核。與對照組相比，高氧組細(xì)胞內(nèi)Pin1的表達明顯增加，差異有顯著性(t=7.476，P＜0.001);4.對照組與高氧組早產(chǎn)兒磷酸化p66Shc Ser36蛋白表達情況:陽性表達染色為金黃色和黃褐色大部分位于胞質(zhì)。與對照組相比，高氧組磷酸化p66Shc Ser36的表達明顯增加，差異有顯著性(t=16.895,P＜0.001);5.線粒體ROS呈紅色熒光，正常對照組紅色熒光較弱，與對照組相比，高氧組紅色熒光明顯

7、增強，活性氧產(chǎn)生增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.586,P＜0.001);6.高氧組活性氧的產(chǎn)生與PKCβ、p66Shc、Pin1和磷酸化p66Shc Ser36蛋白表達呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.893、0.795、0.681、0.663，P均＜0.001)。
　　結(jié)論:高氧能誘導(dǎo)人PBMC內(nèi)PKCβ、P66Shc、Pin1和磷酸化p66Shc Ser36蛋白表達增多，線粒體ROS產(chǎn)生增多，證明PKCβ/p66Shc氧化應(yīng)激信號通