rHu IFN-α2b經(jīng)皮干預(yù)小鼠細(xì)胞因子表達(dá)的皮膚免疫屏障研究.pdf

1、皮膚是人體最大的器官，不僅具有物理屏障防御功能，也被看作是一個(gè)具有獨(dú)特免疫功能并與整個(gè)免疫系統(tǒng)密切相關(guān)的組織器官。1986年Bos提出皮膚免疫系統(tǒng)(SIS)概念，其后Sontheimer。提出的真皮微血管單元(DMU)和Nickoloff等提出真皮免疫系統(tǒng)(DIS)概念，對(duì)SIS進(jìn)行了重要的補(bǔ)充和擴(kuò)展。SIS由體液、細(xì)胞和基因三大部分組成，不但有針對(duì)內(nèi)部抗原的皮膚免疫調(diào)節(jié)體系，也應(yīng)存在針對(duì)外部抗原的皮膚免疫屏障(SIB)。皮膚組織液中細(xì)

2、胞因子能誘動(dòng)、吸引和激活一系列免疫相關(guān)細(xì)胞參與局部免疫，擴(kuò)大淋巴細(xì)胞和特異性抗原的交互作用，完成對(duì)外源性抗原的防御和監(jiān)視。 目前有關(guān)SIB如何作用生物大分子經(jīng)皮給藥的研究在國際上尚處于空白狀態(tài)。因此研究皮膚免疫系統(tǒng)中的免疫屏障和生物大分子經(jīng)皮給藥的相互關(guān)系，分析生物大分子經(jīng)皮給藥時(shí)干預(yù)不同免疫水平下皮膚免疫屏障細(xì)胞因子的表達(dá)特征，對(duì)揭示皮膚免疫屏障對(duì)生物大分子經(jīng)皮吸收過程的影響，以及利用該機(jī)制提出促進(jìn)生物大分子藥物經(jīng)皮吸收的新策

3、略都有重要意義。 以目前臨床常用抗病毒藥物rHu IFN-α2b為生物大分子模型藥物，研究經(jīng)皮給藥對(duì)正常小鼠、表皮LC缺乏小鼠和維A酸皮膚反應(yīng)小鼠皮膚、血液及皮下肌肉中小鼠IFN-α、IFN-γ、IL-18、IL-10、IL-12表達(dá)的干預(yù)作用，以闡明皮膚免疫屏障中細(xì)胞因子針對(duì)生物大分子經(jīng)皮給藥時(shí)的作用機(jī)制。 本課題主要從以下五個(gè)方面考察人重組IFN-α經(jīng)皮給藥后干預(yù)皮膚、皮下肌肉、血液中細(xì)胞因子表達(dá)的特征，并對(duì)表皮LC

4、缺乏和維A酸反應(yīng)模型的建立和驗(yàn)證進(jìn)行了研究和探討。 一、rHu IFN-α2b經(jīng)皮給藥24h干預(yù)BALB/c小鼠細(xì)胞因子表達(dá)的特征1:ELISA法結(jié)果顯示，經(jīng)皮給藥24h小鼠血漿中小鼠IFN-α、IL-18、IFN-γIL-10和IL-12的表達(dá)在不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)空白對(duì)照產(chǎn)生不同程度顯著性變化，提示rHu IFN-α2b經(jīng)皮給藥能產(chǎn)生全身性效應(yīng)。人IFN-α在血漿中表達(dá)保持一定濃度至24h，提示rHuIFN-α 2b經(jīng)皮給藥具有緩

5、釋作用。小鼠肌肉中五種細(xì)胞因子表達(dá)經(jīng)皮給藥后3～6h除IFN-γ外均出現(xiàn)顯著變化，提示肌肉也可能是免疫系統(tǒng)的重要組成部分。 2.體外經(jīng)皮給藥12h顯示，rHu IFN-α 2b體外經(jīng)皮給藥累積滲透曲線符合二項(xiàng)式：v=-33.20x<'2>+872.9x-3.423(r=0.9995)，提示經(jīng)皮滲透是主要限速的因素。同時(shí)抑制了皮膚中小鼠皮膚中IFN-α分泌，在2h、4h和10h表現(xiàn)最顯著；IL-18在10h出現(xiàn)明顯上調(diào)；IFN-γ

6、也可能因?yàn)镮L-18表達(dá)上調(diào)而在10h、12h時(shí)濃度明顯上調(diào)；IL-10、IL-12相對(duì)空白對(duì)照兩者在短時(shí)間內(nèi)并未顯現(xiàn)大幅度的濃度變化。 3.Real-Time PCR法相對(duì)定量結(jié)果顯示，經(jīng)皮給藥24h能引起小鼠皮膚中IFN-α、IL-18、IFN-γ、IL-10、IL-12 mRNA表達(dá)短時(shí)間內(nèi)迅速地幾乎一致性的強(qiáng)烈抑制，給藥3h后各細(xì)胞因子mRNA水平表達(dá)開始出現(xiàn)各自不同程度的調(diào)整。IFN-α和IFN-γ一直處于明顯的抑制狀

7、態(tài)，IL-18在24h恢復(fù)到空白水平，IL-10和IL-12在也處于明顯的抑制狀態(tài)，而且兩者在變化過程中始終保持一定表達(dá)差。表明皮膚免疫屏障的確存在，且對(duì)外源性抗原的有敏感反應(yīng)和辨別力。 4.肌肉中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)也在3～6h出現(xiàn)顯著變化，提示給藥后3～6h藥物進(jìn)入肌肉并引發(fā)肌肉細(xì)胞因子顯著調(diào)整。 二、rHu IFN-α2b連續(xù)經(jīng)皮給藥10d干預(yù)BALB/c小鼠細(xì)胞因子表達(dá)的特征 1.ELISA法結(jié)果顯示，連

8、續(xù)經(jīng)皮給藥10d小鼠血漿中人IFN-α濃度為劇烈起伏變化，不過變化幅度隨時(shí)間推移有減弱的趨勢，提示機(jī)體逐漸產(chǎn)生耐受力；小鼠IFN-α濃度逐漸降低，逐漸被抑制；IL-18的變化幅度很小，基本保持同一水平狀態(tài)；IFN-γ也成上下起伏，幅度較小，而且與人IFN-α變化方向相反；IL-10呈上調(diào)變化，幅度較??；IL-12蛋白質(zhì)水平呈明顯下調(diào)趨勢，第2d最明顯，可能與IL-10上調(diào)產(chǎn)生對(duì)它抑制有關(guān)。 2.Real-Time PCR法相對(duì)定

9、量結(jié)果顯示，連續(xù)經(jīng)皮給藥lOd能在第2d左右引起小鼠皮膚中IFN-α、IL-18、IFN-γ、IL-10、IL-12 mRNA表達(dá)的一致性最強(qiáng)抑制。IFN-α表達(dá)一直處于被抑制狀態(tài)，在10d上調(diào)到最接近空白對(duì)照；IL-18同樣在10d上調(diào)到空白對(duì)照水平：IFN-γ被抑制程度不強(qiáng)，而且從第8d開始表達(dá)明顯上調(diào)，這同血漿中濃度的變化趨勢一致。IL-10、IL-12 mRNA水平表達(dá)兩者變化趨勢十分相象，但是皮膚中IL-10濃度和變化幅度明顯

10、小于IL-12。 三、皮膚LC缺乏小鼠模型的建立和rHu IFN-α 2b經(jīng)皮給藥24h干預(yù)該小鼠模型細(xì)胞因子表達(dá)的特征 1.在小鼠無毛處涂抹CP軟膏，每天一次，連續(xù)8d，藥物引起皮膚LC密度降低，建立皮膚LC缺乏小鼠，采用特異性ATP酶染色檢測小鼠表皮LC密度變化和組織形態(tài)變化情況。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，表皮LC密度明顯下降，給藥8d密度下降到最低值，約只有空白對(duì)照的43.02％左右。且H&E染色顯示皮膚角質(zhì)層完整，表皮明顯變

11、薄，細(xì)胞因子mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)出現(xiàn)顯著抑制。提示此模型可進(jìn)行經(jīng)皮給藥的免疫藥理學(xué)研究。 四、皮膚維A酸皮膚反應(yīng)小鼠模型的建立和rHu IFN-α2b經(jīng)皮給藥24h干預(yù)該小鼠模型細(xì)胞因子表達(dá)的特征 1.在小鼠無毛處涂抹反式RA軟膏，每天一次，連續(xù)8d，藥物引起皮膚LC數(shù)量和表面抗原表達(dá)的變化，建立RA皮膚反應(yīng)小鼠，采用特異性ATP酶染色檢測小鼠表皮LC密度變化。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，表皮LC密度在造模后表達(dá)最高，但顯著低于空

12、白。同時(shí)H&E染色表明皮膚角質(zhì)層已恢復(fù)完整，表皮明顯增厚。細(xì)胞因子mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)出現(xiàn)顯著抑制。提示此模型可進(jìn)行RA免疫調(diào)節(jié)和皮膚免疫屏障研究。 2.ELISA 法結(jié)果顯示，小鼠皮膚中給藥后IFN-α分泌量明顯增加；IL-18分泌量變化幅度較小，濃度與空白對(duì)照無顯著差異；IFN-γ分泌量同空白對(duì)照無顯著差異；IL-10、IL-12相對(duì)空白對(duì)照兩者都未有顯著變化，皮膚中IL-10濃度明顯大于IL-12。 3.ELISA

13、法結(jié)果顯示，在體經(jīng)皮給藥后，小鼠肌肉細(xì)胞因子表達(dá)除IL-10和IL-18均在3～6h出現(xiàn)顯著變化，IL-10和IL-18在12h出現(xiàn)顯著上調(diào)。提示兩種模型雖然同為免疫抑制，但對(duì)調(diào)節(jié)的影響不一致。 4.ELISA法結(jié)果顯示，離體給藥12h給該模型后小鼠人IFN-α滲透率和速度顯著小于正常小鼠皮膚，再次表明表皮經(jīng)藥物作用變厚后不利于藥物的滲透；小鼠IFN-α、IL-18、IFN-γ、IL-10和IL-12在造模后明顯較前一模型和空白

14、小鼠有區(qū)別。 5.Real-Time PCR法相對(duì)定量結(jié)果顯示，經(jīng)皮給藥24h能引發(fā)造模小鼠皮膚中五種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的變化過程較為相似，在快速顯著上調(diào)后迅速回到空白水平，隨后再次顯著上調(diào)，然后逐漸下調(diào)至空白水平。 6.Real-Time PCR法相對(duì)定量結(jié)果顯示，經(jīng)皮給藥24h能引起肌肉中細(xì)胞因子mRNA的劇烈變化，總體趨勢相似，開始被顯著抑制，然后逐漸回調(diào)，IFN-α和IL-18回到空白水平；IFN-γ出現(xiàn)顯著上

15、調(diào)，明顯高于空白對(duì)照值：IL-10微弱回調(diào)，被顯著抑制；IL-12上調(diào)至顯著高于空白水平，與IL-10存在對(duì)抗?fàn)顟B(tài)。 五、rHu IFN-α 2b對(duì)小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子表達(dá)的干預(yù)作用1.MTT法比色法測定rHu IFN-α 2b、CP和RA對(duì)小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞PAM212細(xì)胞系和小鼠成纖維細(xì)胞L-929細(xì)胞系的增殖有不同程度的抑制或誘導(dǎo)作用。 2.ELISA法結(jié)果顯示，rHu IFN-α2b對(duì)PA

16、M212細(xì)胞系、L-929細(xì)胞系以及在CP、RA預(yù)處理后的IFN-α、IL-18、IFN-γ、IL-10和IL-12蛋白質(zhì)水平存在顯著性差異。 3.Real-Time PCR相對(duì)定量結(jié)果顯示人重組IFN-α 2b對(duì)PAM212細(xì)胞系、L-929細(xì)胞系以及在CP、RA預(yù)處理3h后的mRNA表達(dá)存在不同程度的顯著性差異。 人IFN-α體外經(jīng)皮過程符合二項(xiàng)式和機(jī)體內(nèi)持續(xù)較高濃度提示rHu IFN-α 2b經(jīng)皮給藥具有一定緩釋作

17、用。三種不同免疫水平的皮膚無論基礎(chǔ)免疫水平還是人IFN-α 2b經(jīng)皮給藥后皮膚免疫屏障發(fā)揮的作用強(qiáng)度都有顯著性差異，提示皮膚免疫屏障作用的發(fā)揮可能與表皮內(nèi)的LCs的異型抗原遞呈作用密切相關(guān)。經(jīng)皮給藥后皮下肌肉細(xì)胞因子mRNA水平表達(dá)的明顯變化，提示了人IFN-α 2b不但能滲過皮膚進(jìn)入血液，而且繼續(xù)滲入皮下肌肉中，使之顯著響應(yīng)；同時(shí)提示肌肉也應(yīng)是機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)中不可缺少的一分子。本研究為生物大分子藥物如何利用和避免皮膚免疫屏障的干預(yù)提供了