生精干細(xì)胞移植技術(shù)及從胚胎干細(xì)胞獲取生殖細(xì)胞的研究.pdf

1、生精干細(xì)胞移植技術(shù)是由美國(guó)賓夕發(fā)尼亞大學(xué)Brinster教授與其同事在1994年創(chuàng)立的。當(dāng)年他們把帶有外源基因標(biāo)記的小鼠的生精干細(xì)胞懸液注射進(jìn)入同系去除內(nèi)源性生精細(xì)胞的受體小鼠的曲細(xì)精管中，這些供體來(lái)源的生精干細(xì)胞在受體小鼠的曲細(xì)精管中生長(zhǎng)分化最終建立了供體來(lái)源的精子發(fā)生。在隨后的研究中此項(xiàng)移植技術(shù)被不斷延伸用于在不同種屬動(dòng)物之間進(jìn)行生精干細(xì)胞移植，例如：從大鼠移植到小鼠、從敘利亞金黃倉(cāng)鼠移植到小鼠、從狗和兔子移植到小鼠、甚至從人移植到

2、小鼠。然而試驗(yàn)結(jié)果表明供體動(dòng)物和受體動(dòng)物之間的種系差異越大供體來(lái)源的生精干細(xì)胞在受體動(dòng)物曲細(xì)精管中形成的精子發(fā)生就越不完全。小鼠睪丸中的支持細(xì)胞(Sertolicell)似乎不能支持種系差異比倉(cāng)鼠還遠(yuǎn)的動(dòng)物的生精干細(xì)胞在小鼠曲細(xì)精管中生長(zhǎng)和分化。 在我們研究的第一部分，我們?cè)噲D通過(guò)輸出管注射的方法建立生精干細(xì)胞移植系統(tǒng)。由于國(guó)內(nèi)尚無(wú)商品化的帶有外源基因標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，因此我們采用移植大鼠的生精干細(xì)胞到裸鼠睪丸內(nèi)這種方式，以便區(qū)

3、分供體大鼠生精干細(xì)胞與受體小鼠內(nèi)原性生精干細(xì)胞在同一曲細(xì)精管內(nèi)形成的精子發(fā)生。 在進(jìn)行生精干細(xì)胞移植前對(duì)4-6周齡的受體裸鼠進(jìn)行44mg/kgBusulfan腹腔注射，在這個(gè)劑量下Busulfan能夠消除受體裸鼠自身的生精細(xì)胞。注射四周后裸鼠睪丸曲細(xì)精管中已經(jīng)不能看到有明顯的精子發(fā)生的存在，脫落的生精細(xì)胞被排出曲細(xì)精管。 采用Ⅳcollagenase和typsin-EDTA兩步酶消化法消化機(jī)械剪碎的大鼠曲細(xì)精管分離單個(gè)細(xì)

4、胞，單個(gè)細(xì)胞懸液加入Laminin包被的24孔培養(yǎng)板內(nèi)使生精干細(xì)胞與包被的Laminin發(fā)生粘附，在洗去未能粘附的細(xì)胞后收集粘附的細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度到5×106cells/ml，隨后進(jìn)行輸出管注射，每只睪丸大約能夠注射10ul細(xì)胞懸液。 在生精干細(xì)胞移植60-90天后處死受體裸鼠，裸鼠的睪丸在10％中性甲醛中固定24小時(shí)，隨后進(jìn)行石蠟包埋制作切片，石蠟切片在進(jìn)行periodicacid—Schiff和蘇木素染色后于顯微鏡下觀察

5、。結(jié)果表明在接受細(xì)胞移植60天和90天的受體裸鼠曲細(xì)精管中均存在供體來(lái)源的大鼠的精子發(fā)生。由于生精干細(xì)胞在篩選到的全部細(xì)胞中所占份額甚少，因此未能在受體裸鼠曲細(xì)精管中形成大規(guī)模的精子發(fā)生。大鼠精子發(fā)生之所以能夠區(qū)別于小鼠的精子發(fā)生是因?yàn)榇笫蟮拈L(zhǎng)型精子細(xì)胞的細(xì)胞核的形態(tài)與小鼠的十分不同。大鼠長(zhǎng)型精子細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)是細(xì)長(zhǎng)型，類似鐮刀的形態(tài)。然而小鼠的長(zhǎng)型精子細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)為短粗的逗號(hào)樣式，兩者的區(qū)別十分明顯。這個(gè)結(jié)果表明我們已經(jīng)成功實(shí)施

6、了生精干細(xì)胞移植。 第二部分從胚胎干細(xì)胞獲取生殖細(xì)胞的研究 生殖細(xì)胞在負(fù)責(zé)把遺傳信息進(jìn)行一代代的傳遞的同時(shí)也負(fù)責(zé)使受精卵細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞全能性。在很多種動(dòng)物中，生殖細(xì)胞的生成是受預(yù)先存在的母系因素所決定的。與此不同，在哺乳動(dòng)物中，生殖細(xì)胞的形成是在胚胎著床后原腸胚形成的時(shí)期發(fā)生的。在小鼠中，原始生殖細(xì)胞最先出現(xiàn)在受精7.25天的胚胎尿囊的基底部。 用基因定點(diǎn)突變方法所做的基因分析結(jié)果表明由靠近外胚層邊緣的胚外外胚層產(chǎn)生

7、的屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族的骨形成蛋白-4和8b在誘導(dǎo)外胚層細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的過(guò)程中起重要的作用。 近年來(lái)，由于采用原始生殖細(xì)胞和生殖干細(xì)胞進(jìn)行移植來(lái)恢復(fù)生殖能力的研究取得了不同程度的成功，這使得科學(xué)工作者們產(chǎn)生了促使胚胎干細(xì)胞分化為生殖細(xì)胞的想法。最近的研究結(jié)果表明由小鼠和人的胚胎干細(xì)胞形成的擬胚體中包含各種組織的原始細(xì)胞，其中的一些細(xì)胞表達(dá)生殖細(xì)胞的表面標(biāo)志。兩個(gè)不同的科研小組成功地分離了這些自發(fā)分化的生殖細(xì)胞，并且在體外和

8、體內(nèi)的條件下促使其繼續(xù)分化直至形成精子發(fā)生。 男性不育癥在發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)成為了一個(gè)越來(lái)越嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。各種各樣的因素導(dǎo)致了不育癥的發(fā)生，包括：精子數(shù)量嚴(yán)重減少、夫妻結(jié)婚年齡偏大和性病的流行等。在2003年召開(kāi)的人類遺傳學(xué)大會(huì)上很多學(xué)者認(rèn)為使用從胚胎干細(xì)胞衍生的配子來(lái)治療那些由于不育而不能得到一個(gè)帶有自己基因的孩子的夫婦是可行的。 雖然目前有些報(bào)道表明胚胎干細(xì)胞來(lái)源的生殖細(xì)胞樣細(xì)胞可以在體內(nèi)形成精子發(fā)生，但是在這些研究中胚

9、胎干細(xì)胞來(lái)源的供體細(xì)胞并沒(méi)有被移植到受體動(dòng)物的曲細(xì)精管內(nèi)來(lái)產(chǎn)生精子發(fā)生。由于曲細(xì)精管才是精子發(fā)生的自然部位，因此在本研究中我們計(jì)劃從雄性129小鼠胚胎干細(xì)胞(ESCell)形成的擬胚體(EB)中分離出SSEA-1陽(yáng)性細(xì)胞并應(yīng)用retinoicacid(RA)對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，最后再把這些細(xì)胞移植進(jìn)入busulfan處理的同系小鼠的曲細(xì)精管中來(lái)觀察曲細(xì)精管提供的微環(huán)境是否能夠影響這些細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。 根據(jù)以上的結(jié)果，我們認(rèn)為有三個(gè)原

10、因能夠在一定的程度上解釋為何移植的細(xì)胞未能在受體曲細(xì)精管中形成明顯的精子發(fā)生。其一：在進(jìn)行細(xì)胞移植時(shí)由ES衍生的PGC樣細(xì)胞還沒(méi)有完全分化成為生精干細(xì)胞，他們需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)與曲細(xì)精管微環(huán)境進(jìn)行相互作用以促進(jìn)分化。45天的時(shí)間幾乎等于小鼠的生精干細(xì)胞分化為精子所需的必須35天。其二：ES衍生的PGC樣細(xì)胞可能處于比較原始的階段，類似于發(fā)育到12.5天的胚胎中的原始生殖細(xì)胞的狀態(tài)。它們?cè)诰邆渖杉?xì)胞功能前需要與胚胎生殖脊中的體細(xì)胞相互作