緊密連接蛋白Claudin-1在丙型肝炎病毒感染中作用的研究.pdf

1、丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus,HCV）是引起人類丙型肝炎的病原體，其慢性化率高達(dá)85％，與肝硬化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)，嚴(yán)重危害人類健康，已成為全球性的、重要的公共衛(wèi)生問題。迄今，對HCV感染發(fā)病的機(jī)制認(rèn)識不完全清楚，仍然缺乏有效的治療方法，疫苗的研究也遇到很大障礙。在HCV感染過程中，病毒與細(xì)胞表面相應(yīng)受體的結(jié)合是病毒感染復(fù)制的始動環(huán)節(jié)，因此探索HCV的受體在HCV感染發(fā)病中的作用一直是研究的熱點問題。CD81、B族

2、I型清道夫受體（scavengerreceptorclassBtypeI,SR-BI）與HCV包膜蛋白結(jié)合，參與HCV的入胞過程，目前已經(jīng)證實，CD81和SR-BI同時存在是HCV感染肝細(xì)胞的必要條件，但一些非肝源細(xì)胞同時表達(dá)CD81和SR-BI，仍然不能被HCV感染，說明HCV感染肝細(xì)胞可能需要其它特異性因子的共同參與。最新研究發(fā)現(xiàn)，肝臟上高度表達(dá)的claudin-1在HCV入胞過程中發(fā)揮重要的作用，非肝源細(xì)胞在表達(dá)該分子后獲得對HC

3、V的易感性。Claudin-1是構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接的主要蛋白，有4個疏水的跨膜區(qū)，2個細(xì)胞外環(huán)結(jié)構(gòu)（extracellularloop,EL），EL1與HCV入胞密切相關(guān)，針對claudin-1EL1的抗體可以阻斷HCV的感染；此外，claudin-1在介導(dǎo)細(xì)胞間HCV的傳播中起關(guān)鍵作用，細(xì)胞間HCV傳播可逃避宿主免疫系統(tǒng)中和抗體的作用，可能是HCV在宿主體內(nèi)持續(xù)存在的重要原因。因此，深入研究claudin-1在HCV感染中的作用，有助

4、于加深對HCV感染發(fā)病機(jī)制的理解，為抗病毒治療提供新的思路。
　　長期以來，缺乏可靠的供病毒繁殖與傳播的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)一直制約著HCV的研究，2005年Rockefeller大學(xué)HCV研究中心主任CharlesM.Rice教授領(lǐng)導(dǎo)的實驗室報道建立HCV感染細(xì)胞模型，解決了這一瓶頸問題。Rice教授惠贈的HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)（cell-culturederivedHCV,HCVcc），為我們的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。為探討claudin-

5、1在HCV感染中的作用，本研究主要完成了以下三方面的工作：
　　1.HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)
　　使用Rice教授惠贈的包含HCV全長序列的2a型J6/JFH嵌合體質(zhì)粒，酶切線性化后作為模版，在T7RNA聚合酶的作用下，體外轉(zhuǎn)錄獲得全長HCV轉(zhuǎn)錄本，產(chǎn)物經(jīng)RNA電泳鑒定，并電穿孔轉(zhuǎn)染至Huh-7.5細(xì)胞，包裝出病毒顆粒，重新感染原始的（na?ve）Huh-7.5細(xì)胞，并檢測病毒感染性。
　　2.Claudin-1表達(dá)對HCV

6、cc易感性的影響
　　從HepG2細(xì)胞中克隆claudin-1基因，插入pEGFP-C3載體中，構(gòu)建真核表達(dá)載體，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡與Westernblot觀察claudin-1的表達(dá)，檢測claudin-1對HCVcc感染的影響；使用化學(xué)合成claudin-1siRNA序列，抑制Huh-7.5細(xì)胞中claudin-1的表達(dá)，檢測HCVcc感染性的變化。
　　3.γ干擾素對緊密連接的影響及其對HCV感染的影

7、響
　　γ干擾素是促炎細(xì)胞因子，可影響細(xì)胞緊密連接；γ干擾素還參與抗HCV免疫應(yīng)答，本研究對γ干擾素在緊密連接及HCV易感性之間的作用初步探索。TranswellPET膜上培養(yǎng)的腸腺癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞可形成極性結(jié)構(gòu)，與體內(nèi)的肝細(xì)胞相似，采用實時定量PCR與Westernblot檢測Caco-2細(xì)胞上的claudin-1、CD81及SR-BI的表達(dá)情況。比較Caco-2單層細(xì)胞在γ干擾素處理前后跨上皮電阻、FITC標(biāo)記的葡聚糖

8、滲透性以及Caco-2細(xì)胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)的變化，通過激光共聚焦顯微鏡觀察CD81、SR-BI及claudin-1在Caco-2細(xì)胞上的分布情況，檢測γ干擾素對HCVcc感染性的影響。
　　結(jié)果：
　　1.通過體外轉(zhuǎn)錄獲得了FL-J6/JFH全長嵌合體HCVRNA轉(zhuǎn)錄本，經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染Huh-7.5細(xì)胞，在培養(yǎng)上清中檢測到HCV，用該培養(yǎng)上清可以感染原始的Huh-7.5細(xì)胞。
　　2.從HepG2細(xì)胞中克隆claudi

9、n-1基因，成功構(gòu)建了claudin-1的真核表達(dá)載體pEGFP-claudin-1，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后可檢測到融合蛋白EGFP-claudin-1在293T細(xì)胞中的表達(dá)。293T細(xì)胞上外源性瞬時表達(dá)claudin-1后，獲得對HCVcc的易感性。
　　3.化學(xué)合成的siRNA序列可以有效抑制Huh-7.5細(xì)胞上的claudin-1的表達(dá)，并阻斷HCVcc對Huh-7.5細(xì)胞的感染。
　　4.Caco-2細(xì)胞

10、表達(dá)HCV的關(guān)鍵受體：CD81、SR-BI及claudin-1，支持HCVcc的感染。
　　5.γ干擾素可以下調(diào)claudin-1的表達(dá)，造成Caco-2細(xì)胞間緊密連接被破壞，通透性增加。γ干擾素同時影響claudin-1、CD81及SR-BI在細(xì)胞上的分布。γ干擾素處理后Caco-2細(xì)胞對HCVcc的易感性下降。
　　結(jié)論：
　　1.緊密連結(jié)蛋白claudin-1是HCV的重要受體，影響細(xì)胞對HCV的易感性，可能與H