緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、Claudin-5在大鼠SAH后早期腦損傷中的作用.pdf

1、前言
　　 動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage SAH)發(fā)生率在西方國家約10人/10萬人，蛛網(wǎng)膜下腔出血后的腦血管痙攣和早期腦損傷是致死和致殘的主要因為，約12.4％患者在入院前已發(fā)生猝死，出血48小時內(nèi)的死亡率高達(dá)40％-60％，約35％在SAH后24小時內(nèi)死亡。盡管現(xiàn)在在血管內(nèi)技術(shù)、診斷方法、手術(shù)及圍手術(shù)期的管理方面取得了很大的進(jìn)步，蛛網(wǎng)膜下腔出血患者的預(yù)后仍然不佳。蛛網(wǎng)膜下腔出血幸存者

2、中，大多數(shù)存在認(rèn)知缺陷并影響功能狀態(tài)和生活質(zhì)量.而遲發(fā)性血管痙攣發(fā)生于出血后4-5天。這表明，早期死亡的病人并不是因為SAH后遲發(fā)性血管痙攣，John H Zhang等學(xué)者最近提出“早期腦損傷”概念，它指的是蛛網(wǎng)膜下腔出血后形成腦血管痙攣之前的72小時內(nèi)的直接損傷，包括繼發(fā)性損傷。早期腦損傷的特點是顱內(nèi)壓(ICP)急性增高，隨后出現(xiàn)腦灌注壓(CPP)及腦血流量(CBF)逐漸減少，導(dǎo)致全腦缺血。這又引起繼發(fā)損傷，如腦水腫的形成，急性血管收

3、縮；在分子水平上表現(xiàn)為細(xì)胞厭氧呼吸、能量耗竭、興奮性毒性和自由基的形成。蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)早期腦損傷病理生理學(xué)包括血腦屏障(BBB)的破壞、腦水腫及腦缺血，但機(jī)制未明.
　　 研究表明，緊密連接(tight juctions，TJs)是保持血腦屏障(BBB)完整性的重要因素.目前認(rèn)為，TJs由一組分子蛋白元件所構(gòu)成，如，Claudins、occludin等，他們是調(diào)節(jié)物質(zhì)通過細(xì)胞間連接的關(guān)鍵成分，其中Claudin-5是腦

4、微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的特異性蛋白。有研究表明，Claudin-5是形成緊密連接的充要條件。ZO-1是第一個被確定的TJs相關(guān)蛋白，越來越多的證據(jù)顯示ZO-1的缺失會導(dǎo)致TJs結(jié)構(gòu)的破環(huán)。
　　 本實驗采用標(biāo)準(zhǔn)大鼠血管內(nèi)線穿刺法建立SAH動物模型，運(yùn)用透射電鏡觀察BBB超微結(jié)構(gòu)的變化，Western blot檢測BBB緊密連接中ZO-1、Claudin-5的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討ZO-1、Claudin-5在SAH后早期腦損傷中的作用。

5、
　　 材料與方法
　　 按文獻(xiàn)所述，建立標(biāo)準(zhǔn)大鼠血管內(nèi)線穿刺法SAH動物模型。健康成年SD大鼠120只(體重300-350mg，雄性)，隨機(jī)分為6組：對照組(n=20)，假手術(shù)組(n=20)，SAH組(n=20)，SAH+DMSO組(n=20)，SAH+SP600125(10mg/kg)(n=20)和SAH+SP600125(30mg/kg)(n=20)。SP600125(JNK抑制劑)溶解于DMSO溶液中，分別于制備

6、蛛網(wǎng)膜下腔出血動物模型前1小時和蛛網(wǎng)膜下腔出血后6小時腹腔注射.同樣劑量的DMSO(不含抑制劑)腹腔注射SAH組作為SAH+DMSO組。
　　 結(jié)果
　　 1.SAH 24小時，透射電鏡觀察各組腦微血管血內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接(TJs)均顯示有不同程度的開放；緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、Claudin-5表達(dá)水平：Sham組同Control組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(ANOVA，P>0.05)；SAH組和SAH+DMSO組同Sham組比

7、較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(ANOVA，P<0.05)；SAH組同SAH+DMSO組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(ANOVA，P>0.05)。
　　 2.JNK抑制劑SP600125干預(yù)后，透射電鏡觀察腦微血管血內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接(TJs)顯示開放同程度減小；緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、Claudin-5表達(dá)水平：SAH+SP600125(10mg/kg)組同SAH組和SAH+DMSO組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(ANOVA，P>0.05)；SAH+SP6001

8、25(30mg/kg)組同SAH組和SAH+DMSO組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(ANOVA，P<0.05)；SAH+SP600125(30mg/kg)組同SAH+SP600125(10mg/kg)組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(ANOVA，P<0.05)。
　　 3.JNK抑制劑SP600125可改善蛛網(wǎng)膜下腔出血存活大鼠24小時后神經(jīng)行為功能障礙；Sham組無死亡，SAH組、SAH+DMSO組、SAH+SP600125(10mg/kg)、