HO-1基因促進(jìn)緊密連接蛋白Claudin-4表達(dá)增強(qiáng)腸粘膜屏障抗損傷與修復(fù)的作用初步研究.pdf

1、目的:
　　缺血再灌注損傷(Ischemia Reperfusion Injury，IRI)是指組織、器官缺血一段時(shí)間后，血管再通，組織器官灌注重新恢復(fù)后，細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而較缺血時(shí)進(jìn)一步加重，器官功能進(jìn)一步惡化的臨床綜合征。研究表明缺血再灌注損傷的早期變化為腸道屏障遭到破壞，腸粘膜通透性增強(qiáng)。上皮細(xì)胞間緊密連接是構(gòu)成腸粘膜屏障的重要組成部分，能夠防止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)如毒素或細(xì)菌穿過腸黏膜進(jìn)入體內(nèi)其他組織器官和血液循環(huán)。

2、各種原因引起的腸粘膜屏障的損害是導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂和全身性感染的扳機(jī)。因此腸屏障功能已成為判斷危重病人預(yù)后的重要指標(biāo)，腸道不僅是多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的靶器官，更是MODS的啟動(dòng)者。而眾所周知，血紅素氧化酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）是唯一可以被誘導(dǎo)的血紅素氧化酶，是生物體內(nèi)血紅素分解的限速酶。血紅素降解產(chǎn)生三種產(chǎn)物在抗氧化、細(xì)胞內(nèi)外

3、信息的傳遞以及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要的生理功能。研究表明HO-1及其代謝參與體內(nèi)各種氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗炎、抗凋亡及細(xì)胞保護(hù)作用。因此有學(xué)者認(rèn)為HO-1是未來治療胃腸道疾病的重要靶點(diǎn)。本研究通過建立大鼠缺血再灌注損傷模型及腸粘膜屏障體外模型觀察腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白HO-1和Claudin-4蛋白表達(dá)的變化，以進(jìn)一步揭示小腸缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制。
　　方法:
　　采用“腸系膜上動(dòng)脈結(jié)扎60min法”建立

4、大鼠腸缺血再灌注模型，構(gòu)建人HO-1基因過表達(dá)載體并建立HO-1基因過表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞株。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對象分為為6組，分別為假手術(shù)組，腸系膜缺血后再灌注3、6、12、24、48h組，每組5只;細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組Caco-pS/HO-1和空白對照組Caco-pS2。采用SYBR Green相對定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)、蛋白免疫印跡法(Western Blot)以及免疫組織化學(xué)檢測缺血再灌注損傷后個(gè)時(shí)間點(diǎn)及過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染前后HO-

5、1及Claudin-4 mRNA及蛋白的表達(dá)水;行CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和免疫熒光法觀察HO-1分子在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1.RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示緊密連接蛋白claudin-4在缺血再灌注后3h后蛋白表達(dá)逐漸升高，于12h達(dá)到最高，隨后逐漸恢復(fù)正常;
　　2.雙酶切及雙向測序證實(shí)載體構(gòu)建成功，并于Caco-2細(xì)胞內(nèi)WB和PT-PC

6、R證實(shí)。免疫熒光染色后，經(jīng)共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，HO-1蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜;
　　3.CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)顯示:第五天對照組pS∶3.2500±0.2477實(shí)驗(yàn)組pS/HO-1∶5.4300±0.2497，與對照組相比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力明顯高于對照組(P＜0.05)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞于劃痕后48小時(shí)劃痕愈合，而對照組不愈合。48小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組、對照組細(xì)胞劃痕平均寬度為分別為(17.25±7.31)vs(126.

7、37±11.14)μm(P＜0.05)。
　　4.HO-1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞后，經(jīng)Western Blot檢測示緊密連接蛋白Claudin-4明顯增加(1.04±0.15)vs(0.50±0.07)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立大鼠小腸缺血再灌注損傷動(dòng)物模型;
　　2.成功構(gòu)建HO-1基因真核過表達(dá)載體并建立HO-1基因過表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞株;
　　3.緊密連接蛋白Claudin-