塞來(lái)昔布和氨芬酸對(duì)血管皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)下恒河猴視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的比較及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：本研究通過(guò)測(cè)定塞來(lái)昔布(Celecoxib)、氨芬酸(Amfenac)及曲安奈德(Triamcinolone acetonideon)對(duì)VEGF165誘導(dǎo)RF/6A細(xì)胞的增殖抑制率及細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞分裂周期、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)分泌量及環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)mRNA、VEGF受體-2(VEGFreceptor-2，KDR)mRNA、基質(zhì)金屬蛋白酶-2

2、(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)mRNA、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-2、-3(tissue inhibitor ofmetalloproteinase-2、-3，TIMP-2、TIMP-3)mRNA的相對(duì)表達(dá)量的影響，研究并比較上述藥物對(duì)RF/6A細(xì)胞增殖及遷移行為的抑制作用差異及機(jī)制。
　　方法：本研究分為正常對(duì)照組、VEGF165作用組、VEGF165+Celecoxib組、VEGF165+

3、Amfenac組、VEGF165+TA組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。
　　1、RF/6A單細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約1×104/ml)接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后，棄上清；用僅含有終濃度為25ng/ml的VEGF165及VEGF165聯(lián)合三種藥物IC50濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h、48h、72h分別行MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率。棄20μl培養(yǎng)液后，于測(cè)試前4h每孔加入等量MTT(5mg/ml)孵育4h，終止培養(yǎng)；

4、棄液加入DMSO150μl，振蕩5min，使紫色結(jié)晶完全溶解，于酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處吸光值A(chǔ)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率并推算藥物的IC50值。細(xì)胞抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值2、將RF/6A細(xì)胞以1×106/ml密度接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，進(jìn)行細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)。利用無(wú)菌10μ ltip槍頭在孔中央對(duì)細(xì)胞作一條約0.8mm的劃痕，更換正常或含有相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基，溫箱培育48h后觀(guān)察劃痕兩側(cè)的細(xì)胞間距離變化(μ m)，低倍鏡下(×40)拍

5、照，利用Image Pro-Plus圖像處理軟件測(cè)量“裸區(qū)”面積，利用Image J圖像處理器分析“裸區(qū)”像素前后改變，測(cè)定三種藥物對(duì)VEGF165誘導(dǎo)下細(xì)胞遷移能力的影響。
　　3、將不同處理組的細(xì)胞消化后調(diào)整細(xì)胞數(shù)量>1×105/ml的單細(xì)胞懸液，離心后，70％乙醇固定，4℃放置過(guò)夜，加入RNA酶，濃度為50μg/ml，37℃水浴30min，加入PI染液并使最終濃度為100μg/ml，避光30minDNA染色，利用流式細(xì)胞儀測(cè)

6、定三種藥物對(duì)正常及VEGF165誘導(dǎo)下RF/6A細(xì)胞分裂周期的影響。
　　4、酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定三種藥物對(duì)VEGF165誘導(dǎo)下RF/6A細(xì)胞PGE2的分泌量的影響：按照比例稀釋原倍標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)立空白孔調(diào)零后，450nm波長(zhǎng)依次測(cè)量各孔吸光度OD值，利用標(biāo)準(zhǔn)品與吸光度之間的回歸方程，測(cè)量相應(yīng)吸光度OD值對(duì)應(yīng)的含量。
　　5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)三種藥物對(duì)VEGF165誘導(dǎo)下RF/6A細(xì)胞COX-2mRNA、K

7、DRmRNA、MMP-2mRNA、TIMP-2mRNA、TIMP-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異：采用trizol法提取RNA、比較閾值法測(cè)定mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　統(tǒng)計(jì)方法：計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及單因素方差分析；組內(nèi)兩兩比較采用Dunnett t檢驗(yàn)及LSD檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用pearson相關(guān)性分析，P<0.05為差異具有顯著性。
　　結(jié)果
　　1.celecoxib對(duì)正常RF/6A

8、細(xì)胞增殖的抑制率及IC50值測(cè)定celecoxib作用于正常RF/6A細(xì)胞24h、48h、72h組的吸光度A值經(jīng)差異行組間單因素方差分析顯示差異具有顯著性(F=4.76、3.88、4.29，P<0.05)，Dunnett檢驗(yàn)對(duì)照組與各濃度組的吸光度A值差異，除24h及72h兩組內(nèi)0.01μ m/l差異無(wú)顯著性(T=2.34、1.89，p>0.05)，其余組間差異具有顯著性；對(duì)照組及不同濃度組吸光度A值經(jīng)單因素方差分析顯示，除對(duì)照組差異無(wú)

9、顯著性(F=1.29，p>0.05)，其余濃度組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，行LSD檢驗(yàn)顯示，0.1及0.01μm/l濃度組的48h與72h的吸光度A值差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(q=3.04、3.33，p>0.05)，其余濃度組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。吸光度A值隨時(shí)間增加而增加，具有時(shí)間依賴(lài)性。選擇48h為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的觀(guān)察點(diǎn)，藥物的IC50值為17.33μm/l。
　　2、Amfenac對(duì)正常RF/6A細(xì)胞增殖的抑制率及IC

10、50值測(cè)定Amfenac作用正常RF/6A細(xì)胞24h、48h、72h組的吸光度A值經(jīng)差異行組間單因素方差分析顯示差異具有顯著性(F=3.98、4.62、4.01，P<0.05)，Dunnet t檢驗(yàn)各濃度組的吸光度A值差異顯示，除72h組內(nèi)0.1μm/l、0.01μm/l的吸光度A值與對(duì)照組差異無(wú)顯著性(T=2.02，p>0.05)，其余相同組間不同濃度吸光度A值差異具有顯著性；對(duì)照組及不同濃度組吸光度A值經(jīng)單因素方差分析顯示，對(duì)照組差

11、異無(wú)顯著性(F=2.12，p>0.05)，其余濃度組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，行LSD檢驗(yàn)顯示，除0.01μm/l濃度組內(nèi)48h與72h的吸光度A值差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(q=4.42，p>0.05)，其余各濃度組內(nèi)不同時(shí)間組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。吸光度A值隨時(shí)間增加而增加，具有時(shí)間依賴(lài)性。選擇48h為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的觀(guān)察點(diǎn)，藥物的IC50值為17.33μm/l。
　　3、Celecoxib及Amfenac不同濃度的細(xì)胞抑制率比較：<

12、br>　　抑制率48h細(xì)胞抑制率經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示，差值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，48h時(shí)間點(diǎn)Amfenac對(duì)RF/6A細(xì)胞的抑制率較Celecoxib明顯。
　　4、48h Celecoxib、Amfenac及TA對(duì)VEGF165誘導(dǎo)RF/6A細(xì)胞的吸光度A值及細(xì)胞抑制率比較不同實(shí)驗(yàn)組的吸光度A值經(jīng)單因素方差分析表明差異具有顯著性(F=65.62，p=0.000)。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的吸光度A值差異行Dunnett t檢驗(yàn)

13、顯示，差異具有顯著性(p<0.05)，VEGF165組吸光度A值高于對(duì)照組；不同實(shí)驗(yàn)組抑制率行單因素方差分析顯示差異具有顯著性(F=69.38，p=0.000)，行LSD檢驗(yàn)顯示三組藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率均有差異(p=0.000、0.000、0.019)。
　　5、Celecoxib、Amfenac及TA對(duì)細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)比較對(duì)細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)前后“裸區(qū)”面積變化像素差異行單因素方差分析顯示組間差異具有顯著性(F=536.427，p=

14、0.000)；行Dunnett t檢驗(yàn)差異具有顯著性，其中VEGF165組像素值高于對(duì)照組(p=0.011)；實(shí)驗(yàn)組行LSD檢驗(yàn)行組間兩兩比較差異具有顯著性(p=0.000、0.001、0.000)，其中VEGF165+Celecoxib組的像素降低最為明顯，其次為VEGF165+TA組及VEGF165+Amfenac組。
　　6、Celecoxib、Amfenac及TA對(duì)正常及VEGF165誘導(dǎo)RF/6A細(xì)胞周期的影響Celec

15、oxib、Amfenac及TA對(duì)正常RF/6A細(xì)胞分裂周期G1、S期所占細(xì)胞周期比例經(jīng)單因素方差分析顯示差異具有顯著性(F=107.613、1156.981，P=0.000、0.000)：Dunnett t檢驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組與各對(duì)照組細(xì)胞所占百分比差異具有顯著性(P=0.001、0.000)；行LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較顯示，除Celecoxib組與TA組對(duì)G1期、S期所占細(xì)胞周期比例差異無(wú)顯著性(p=0.143)，其余組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

16、
　　Celecoxib、Amfenac及TA對(duì)VEGF165誘導(dǎo)RF/6A細(xì)胞分裂周期G1、S期所占細(xì)胞周期比例經(jīng)單因素方差分析顯示差異具有顯著性(P<0.05)；Dunnett t檢驗(yàn)顯示各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞所占百分比差異具有顯著性(p=0.001、0.000)；行LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較顯示，除Celecoxib組與TA組對(duì)G1期、s期所占細(xì)胞周期比例差異無(wú)顯著性(p=0.630)，其余組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論

17、
　　1.Celecoxib、Amfenac及TA可抑制VEGF165誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞增殖，其機(jī)制為增加G1期、降低S期所占細(xì)胞周期比重，Amfenac的抑制作用強(qiáng)于Celecoxib及TA。
　　2.Celecoxib、Amfenac及TA可抑制VEGF165誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞遷移，但抑制機(jī)制不同。Celecoxib通過(guò)抑制COX-2-PGE2-MMPs系統(tǒng)、降低MMP-2：TIMP-2比值及KDRmRNA的相對(duì)表達(dá)