不同病因致小鼠角膜與虹膜新生血管及淋巴管增殖的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 建立小鼠角膜縫線、前房植入生長因子bFGF和同種異體角膜移植動物模型，檢測不同致病因素作用下角膜新生血管和新生淋巴管的生長情況，檢測虹膜血管以及淋巴管相關(guān)因素的變化情況。 方法： 一、建立小鼠不同致病因素角膜新生血管及淋巴管動物模型1、角膜縫線法選取BAILB/c小鼠32只，腹腔注射氯胺酮和氯丙嗪麻醉后，首先用直徑2mm的角膜環(huán)鉆在角膜中央輕壓作壓痕，用11-0尼龍線垂直壓痕方向做角膜縫線。 2、

2、前房植入堿性成纖維生長因子bFGF將22只BALB/c小鼠隨機(jī)分為兩組，A組前房植入空白載體，B組前房植入bFGF 80ng。手術(shù)方法：麻醉成功后，用尖刀片于周邊部角膜作板層切口，穿透前房，將含有生長因子bFGF的緩釋藥及空白載體植入下方前房角，11-0尼龍線縫合角膜切口。 3、同種異體角膜移植手術(shù)對22只BALB/c小鼠行右眼同種異體穿透性角膜移植術(shù)，供體角膜來自于C57BL/6小鼠。 二、免疫熒光和組織病理學(xué)檢測各組

3、小鼠術(shù)后3、5、7、14天分別取2～4只眼球，制作眼球冰凍切片、角膜鋪片、虹膜鋪片，應(yīng)用LYVE-1、CD31和CD11b進(jìn)行免疫熒光染色，觀察角膜血管和淋巴管的生長情況，虹膜血管以及淋巴管相關(guān)因素的變化情況。術(shù)后7天取眼球做石蠟切片HE染色，組織病理學(xué)檢測。 三、分子生物學(xué)檢測角膜及虹膜VEGFR-3、VEGF-A、VEGF-C的表達(dá)取角膜縫線法術(shù)后7天、14天和正常小鼠，提取角膜及虹膜mRNA，RT-PCR方法檢測與淋巴管相

4、關(guān)的生長因子及受體VEGFR-3、VEGF-A、VEGF-C的表達(dá)情況。 四、角膜新生血管和淋巴管組織超微結(jié)構(gòu)的觀察縫線法及前房植入生長因子組小鼠術(shù)后5天，14天各取3只，行透射電鏡檢查，觀察不同時間角膜血管和淋巴管的超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果： 1、裂隙燈觀察動物模型新生血管的生長情況(1)角膜縫線組：術(shù)后3天新生血管呈弧形或袢狀侵入角膜。術(shù)后5天新生血管垂直于角膜緣密集伸入角膜。術(shù)后7天，血管進(jìn)一步生長，長入縫線。拆除

5、縫線后，血管逐漸消退，至術(shù)后14天僅殘留少量血管影。(2)前房植入生長因子bFGF組：術(shù)后第1天角膜水腫，可見淡黃色透明緩釋載體位于下方虹膜的前方。術(shù)后3天角膜水腫明顯、基質(zhì)增厚，可見新生血管生長，虹膜血管怒張。術(shù)后5天大量新生血管垂直于角膜緣密集長入角膜。術(shù)后7天，血管進(jìn)一步生長。術(shù)后14天血管變細(xì)消退，僅殘留少量血管影，前房緩釋載體變小。(3)同種異體角膜移植組：術(shù)后3天角膜植片輕度水腫，角鞏緣新生血管怒張，少量新生血管伸入植床邊緣

6、。術(shù)后7天角膜植片水腫、混濁，新生血管長入植床，部分到達(dá)植片。拆除角膜縫線后，新生血管迅速消退。術(shù)后14天，角膜植片仍保持透明，術(shù)后3～4周開始出現(xiàn)排斥反應(yīng)。 2、免疫熒光染色(1)角膜縫線組：角膜鋪片觀察正常角膜僅在角膜緣處可見CD31陽性血管網(wǎng)呈袢狀分布，少量LYVE-1陽性淋巴管以膨大的盲端出現(xiàn)于角膜緣。縫線術(shù)后7天，可見大量血管呈樹枝狀垂直角膜緣方向長入角膜，血管密集，末端尖銳毛刺狀。LYVE-1陽性淋巴管伴隨血管呈火焰

7、狀伸入角膜中央，以盲端結(jié)束，管腔粗，形態(tài)不規(guī)則，角膜基質(zhì)內(nèi)可見散在的LYVE-1弱陽性樹枝狀細(xì)胞。縫線術(shù)后14天，血管明顯變細(xì)，末端吻合成血管袢。淋巴管也變細(xì)變短，末端鈍圓，部分淋巴管與角膜緣淋巴管斷開，形成孤立于角膜基質(zhì)中的短小管狀結(jié)構(gòu)，周圍基質(zhì)內(nèi)可見散在的LYVE-1陽性樹枝狀細(xì)胞，雙重染色顯示為CD11b陽性。 虹膜鋪片可見正常虹膜內(nèi)放射狀排列的虹膜血管；縫線術(shù)后7天血管密度增加，管腔明顯增粗，血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬。正常虹

8、膜組織內(nèi)存在少量LYVE-1陽性的、形態(tài)如樹枝狀的細(xì)胞，多集中分布于虹膜瞳孔緣，而縫線術(shù)后及角膜微囊袋術(shù)后7天，該類細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，散在分布于虹膜睫狀體內(nèi)，虹膜中外及睫狀體側(cè)密度較高。雙重免疫熒光染色顯示為CD11b陽性、F4/80陽性，為骨髓來源的巨噬細(xì)胞中的一部分。 (2)前房植入生長因子bFGF組：術(shù)后7天，眼球冰凍切片可見角膜增厚明顯，全層大量CD31陽性血管表達(dá)，淺中層基質(zhì)內(nèi)可見角膜淋巴管生長；虹膜增生肥厚，大量血

9、管表達(dá)，虹膜晶狀體面可見較多的LYVE-1陽性細(xì)胞，沿虹膜色素上皮表面分布，延續(xù)至睫狀體。虹膜鋪片見大量的LYVE-1陽性細(xì)胞，形態(tài)不規(guī)則，散在填充于虹膜血管周圍間隙內(nèi)，未見明顯的管狀結(jié)構(gòu)，未見LYVE-1陽性淋巴管。 (3)同種異體角膜移植組：PKP術(shù)后3天角膜鋪片，周邊可見袢狀和毛刺狀的血管及淋巴管，管腔均較粗。術(shù)后7天，可見大量的血管及淋巴管陽性表達(dá)，部分區(qū)域已經(jīng)達(dá)到角膜植片。CD11b染色顯示角膜基質(zhì)中兩種形態(tài)的細(xì)胞浸潤

10、，一種為樹枝狀的巨噬細(xì)胞，另一種為圓型的炎癥細(xì)胞。淋巴管周圍亦可見LYVE-1陽性巨噬細(xì)胞。術(shù)后14天，血管的數(shù)量和密度大大降低，管腔變細(xì)。淋巴管消退較慢，末端變鈍圓。CD11b+細(xì)胞較前明顯減少。 虹膜鋪片PKP術(shù)后3天，血管增粗，密度增加，LYVE-1陽性細(xì)胞幾乎消失。CD11b染色可見虹膜表面大量圓型炎細(xì)胞浸潤，樹枝形態(tài)細(xì)胞少見。術(shù)后7天虹膜血管粗大，走形僵直。LYVE-1陽性細(xì)胞有所增加，形態(tài)不規(guī)則，可見小橢圓形細(xì)胞，也

11、可見樹枝狀細(xì)胞。圓形CD11b陽性細(xì)胞減少，巨噬細(xì)胞則較前增多。術(shù)后14天，虹膜血管仍較正常粗，走形僵直，LYVE-1陽性細(xì)胞數(shù)量較前明顯增加，形態(tài)以樹枝狀為多?？梢姶罅緾D11b陽性巨噬細(xì)胞均勻分布于虹膜內(nèi)。 3、RT-PCR檢測縫線術(shù)后角膜及虹膜中各因子的變化情況結(jié)果顯示，角膜和虹膜中的VEGFR-3在縫線術(shù)后7天表達(dá)上調(diào)，并且角膜和虹膜中的生長因子VEGF-A和VEGF-C在術(shù)后不同時間的變化趨勢一致。 4、角膜新

12、生血管和新生淋巴管組織超微結(jié)構(gòu)的觀察淋巴管的腔較大，管壁不規(guī)則，由連續(xù)的單層內(nèi)皮細(xì)胞圍成。內(nèi)皮細(xì)胞除核周區(qū)以外，其余部分的胞質(zhì)都很薄，為連續(xù)型，無窗孔，無周細(xì)胞和基底膜，或于內(nèi)皮細(xì)胞連接處偶見少量基底膜。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的連接有3種類型，即端端連接、重疊連接和嵌插連接。 結(jié)論： 角膜縫線法、前房植入生長因子bFGF和同種異體角膜移植均可建立角膜新生血管和新生淋巴管生長的動物模型。角膜新生血管和新生淋巴管的生長與消退存在著不