豬4個(gè)新基因的分離、物理定位及MyoG基因SNP研究.pdf

1、利用比較基因組學(xué)方法分離基因是一種新穎有效的方法，其基本原理是運(yùn)用人、小鼠和豬等物種間存在的基因同源性，在基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物分離基因，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用這種方法成功分離了豬的許多新基因。根據(jù)比較基因組學(xué)的研究，豬SSC11(susscrofachromosome11)和人HSA13(Homosapienschromosome13)間存在著很大同源性，人HSA13存在496個(gè)基因，估計(jì)SSC11至少也有400個(gè)基因，截止目前，豬11號(hào)染色體

2、上分離、定位的基因不足30個(gè)，所以豬SSC11新基因的分離、定位已勢(shì)在必行。本文成功分離了豬GAS6、POSTN、CDC16和EFNB2等4個(gè)新基因，并運(yùn)用SCHP和IMpRH克隆板將這4個(gè)新基因進(jìn)行了物理定位于SSC11，這對(duì)于豐富豬11號(hào)染色體的物理圖譜和了解不同物種染色體的進(jìn)化具有重要的理論意義，并為這些基因功能的研究打下良好的基礎(chǔ)。 本論文根據(jù)比較基因定位信息，分離和物理定位了豬11號(hào)染色體上的4個(gè)新基因，并對(duì)MyoG基

3、因進(jìn)行了SNP分型研究，取得了如下結(jié)果： 1.依據(jù)人13號(hào)、小鼠8號(hào)染色體上的同源基因保守序列設(shè)計(jì)引物，從寧鄉(xiāng)豬和大圍子豬基因組中分離了4個(gè)新基因的6個(gè)片段，并提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，這6個(gè)片段分別是豬GAS6基因內(nèi)含子9，POSTN基因內(nèi)含子18，CDC16基因內(nèi)含子4和內(nèi)含子8，EFNB2基因3'-UTR和內(nèi)含子3，GenBank收錄號(hào)分別為AY880668、AY880669、AY880670、DQ206823、AY880

4、671和DQ206822。 2.用豬×嚙齒類(lèi)體細(xì)胞雜種板將4個(gè)新分離的豬基因進(jìn)行染色體區(qū)域定位，將GAS6基因、CDC16基因和EFNB2基因定位于SSC11q11～q17，定位概率P分別為0.9976、0.9998和1.0000，與該區(qū)域標(biāo)記間的相關(guān)系數(shù)分別為0.7906、0.8563和0.7802，誤差概率P都小于0.1％；將POSTN基因定位于SSC11p11～15，P=0.9992，與該區(qū)域標(biāo)記間的相關(guān)系數(shù)為0.7031

5、，P＜0.1％。 3.用豬輻射雜種板將4個(gè)新分離的豬基因進(jìn)行染色體精細(xì)定位，結(jié)果這4個(gè)基因均與豬11號(hào)染色體上的微衛(wèi)星標(biāo)記緊密連鎖，GAS6基因與SW1452緊密連鎖，LOD=16.88，存留率為22％，在放射雜交圖譜上的圖距為56cR；POSTN基因與SW1486緊密連鎖，LOD=15.87，存留率為35％，在放射雜交圖譜上的圖距為67cR；CDC16基因與SW1452緊密連鎖，LOD=16.08，存留率為22％，在放射雜交圖

6、譜上的圖距為62cR；EFNB2基因與SW903緊密連鎖，LOD=6.86，存留率為29％，在放射雜交圖譜上的圖距為56cR。 4.將4個(gè)新基因的定位結(jié)果與已公布的豬11號(hào)染色體RH圖譜整合，獲得一張豬11號(hào)和人13號(hào)染色體的同源基因比較定位圖，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)新基因在豬11號(hào)染色體上的排列順序是POSTN-GAS6-CDC16-EFNB2，后3個(gè)基因的排列順序與小鼠8號(hào)染色體上的完全相同，而與人13號(hào)染色體上排列順序POSTN-EF

7、NB2-GAS6-CDC16略有不同。 5.選擇遺傳差異較大的湖南地方品種大圍子豬和國(guó)外品種長(zhǎng)白豬、大白豬各20頭，利用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法，在GAS6基因內(nèi)含子9第20、172和246bp位置發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNP，均為A/G，在第28，136，257，263位置發(fā)現(xiàn)了4個(gè)突變，分別是A/G、G/C、A/G和A/G。6.選擇與人CDC16基因有高度同源(90％以上)的豬的BP436622、AJ656153、CJ022837和BP161

8、802等4個(gè)EST，構(gòu)建毗連群，電腦克隆了豬CDC16基因cDNA，其長(zhǎng)度為2057bp，其中5'-UTR為119bp，3'-UTR為75bp，ORF為長(zhǎng)1863bp，編碼617個(gè)氨基酸。 7.分析了人、小鼠、大鼠、黑猩猩、豬和酵母等CDC16蛋白氨基酸序列差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬與人、鼠和酵母的同源性分別為97.6％、95.3％、38.5％，大鼠和小鼠的同源性最高，其次是豬，然后是人。 8.通過(guò)分析與人CDC16基因有高度同

9、源性的4個(gè)EST(BP436622、AJ656153、CJ022837和BP1618O2)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)候選的8NP，1個(gè)候選的14bp缺失突變(缺失序列GTTTGGAAACCCAG)。 9.通過(guò)PCR-RFLP方法，檢測(cè)了大約克豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克豬等外來(lái)品種和湖南地方品種寧鄉(xiāng)豬、沙子嶺豬、大圍子豬和桃源黑豬共831頭MyoG基因3'端353bp側(cè)翼序列，MspⅠ酶切后存在AA、AB和BB三種基因型，其中外來(lái)品種中BB占優(yōu)勢(shì)，B等位