2型糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道電流的變化.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)運(yùn)用全細(xì)胞穿孔膜片鉗技術(shù)觀察2型糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(big conductance calcium activated potassium channel, BKca)的電流變化,探討B(tài)Kca與2型糖尿病血管病變之間的關(guān)系。方法:1.2型糖尿病大鼠模型的建立:雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后稱(chēng)體重,隨機(jī)分為兩

2、組,對(duì)照組以普通飼料喂養(yǎng),高脂組喂以高脂高糖飼料。4周后高脂組SD大鼠腹腔一次性注射STZ25mg/kg(pH4.2的0.1mol/L枸櫞酸緩沖液配成0.25％濃度);對(duì)照組腹腔注射等體積的0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液。2.2型糖尿病大鼠模型的鑒定:于STZ注射一周后心臟采血測(cè)空腹血糖、血脂、血胰島素含量,成模鼠繼續(xù)高脂喂養(yǎng),于8、12周末分批用3％戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉后,取胸主動(dòng)脈及腸系膜小動(dòng)脈供試驗(yàn)用。3.膜片鉗

3、實(shí)驗(yàn):(1)細(xì)胞懸液制作:將分離的動(dòng)脈剪切成碎片,置于細(xì)胞分離液中,37℃恒溫水浴振蕩,經(jīng)酶液兩步消化使細(xì)胞間質(zhì)及周?chē)倪B接組織被酶解,然后將被消化后的動(dòng)脈組織放于無(wú)鈣臺(tái)式液中,選取具有較強(qiáng)立體感表面光滑的平滑肌細(xì)胞,采用全細(xì)胞穿孔膜片鉗技術(shù)記錄電流。(2)全細(xì)胞穿孔膜片鉗步驟:在室溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),使微管電極尖端與周?chē)?xì)胞間形成電化學(xué)絕緣,阻抗約10～100GΩ,形成全細(xì)胞構(gòu)型。用Clampex10.1軟件采集電流,Clampfit10.

4、1軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,統(tǒng)計(jì)電流幅值和制作I-V曲線。(3)單通道膜片鉗步驟:在形成全細(xì)胞構(gòu)型后,將電極尖端提出液面,再放回浴液中形成內(nèi)面向外式膜片;用pClamp9.0軟件記錄通道的電流信號(hào)。結(jié)果:1.通道的開(kāi)放概率隨著電壓和單通道浴液中的Ca2+濃度的增加而增大。2.急性酶分離的大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs BKca電流的基本特性:(1) BKca宏觀電流具有明顯的電壓、鈣依賴(lài)性及外向整流的性質(zhì);(2)比較對(duì)照組、高脂組八周、高脂組十二周

5、BKca電流:對(duì)照組(n=8)、高脂八周組(n=6)、高脂十二周組(n=6)的電流幅值分別為352.31±82.56 pA(+60mV)、719.25±45.03 pA(+60 mV)、911.58±77.82 pA(+60 mV)。經(jīng)t檢驗(yàn),對(duì)照組與高脂八周組,t=9.785,P<0.05;正常組與高脂十二周組,t=12.845, P<0.05;高脂八周與高脂十二周組,t=5.240,P<0.05。3.急性酶分離的大鼠腸系膜動(dòng)脈VSM

6、Cs BKca電流的基本特性:(1)BKca宏觀電流具有明顯的電壓、鈣依賴(lài)性及外向整流的性質(zhì);(2)比較對(duì)照組、高脂組八周、高脂組十二周BKca電流:對(duì)照組(n=5)、高脂八周組(n=5)、高脂十二周組(n=5)的電流分別為169.88±67.13 pA(+60mV)、330.41±55.04pA(+60 mV)、568.77±62.97pA(+60 mV)。經(jīng)t檢驗(yàn),對(duì)照組與高脂八周組,t=4.135, P<0.05;對(duì)照組與高脂十二