褪黑素對2型糖尿病血管平滑肌細胞的保護作用及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病是由于胰島素分泌不足或胰島素抵抗，導致高血糖，容易引起的一系列并發(fā)癥，例如糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變、心血管病變。其中心血管病變導致死亡占糖尿病死亡的超過半數(shù)，消耗大量的社會醫(yī)療資源，尤其在中國進入老齡化社會后，醫(yī)療支出急劇上升。雖然臨床上已經(jīng)有不少治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物和手段，但是藥物治療面臨諸多問題，例如藥品來源匱乏、費用過高、療效欠佳、易引發(fā)各種副作用等，因此臨床上尋找糖尿病及其并發(fā)癥的藥物治療，極為迫

2、切，也成為目前研究重點之一。
　　褪黑素為內(nèi)源性分子，而且分子量極小為232.28，主要來源于松果體。褪黑素的分泌受視交叉上核所控制，白天分泌減少，晚上分泌增多。強光下分泌減少，黑暗下分泌增多。目前研究發(fā)現(xiàn)褪黑素不僅調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、改善睡眠，而且具有強烈的抗氧化應激作用，可清除自由基，消除炎癥等作用。在心血管保護、肥胖、代謝綜合癥及糖尿病及其并發(fā)癥方面發(fā)揮有益的作用。
　　Notch信號通路作為高度保守的細胞-細胞通路，可影響

3、著細胞生長、存活、凋亡、分化等過程。本課題組已經(jīng)證實了，在糖尿病心肌缺血/再灌損傷中褪黑素可激活Notch1/Hes1通路，發(fā)揮保護效應，而在糖尿病大血管病變的損傷的研究尚未見報道。JAKs信號通路也涉及許多細胞反應：細胞生存、分化、凋亡等。本課題組已經(jīng)研究了褪黑素可通過激活JAK2/STAT3信號通路抗心肌缺血/再灌損傷。在糖尿病大血管病變的損傷的研究尚未見報道。
　　研究目的：為了明確褪黑素在糖尿病大血管損傷中的保護機制，本研

4、究通過動物試驗和細胞實驗進行探討：
　　1)探討褪黑素可否抗糖尿病引起的血管平滑肌損傷。
　　2)探究褪黑素是否能激活Notch1/Hes1及JAK2/STAT3信號通路抗糖尿病血管平滑肌損傷。
　　3)探究在褪黑素抗糖尿病血管平滑肌損傷中，Notch1/Hes1與JAK2/STAT3信號通路之間的調(diào)控關(guān)系。
　　方法：
　　1)高脂飲食結(jié)合STZ腹腔注射誘導建立糖尿病動物模型。
　　2)高脂高糖處理

5、平滑肌細胞建立離體糖尿病模型。
　　3)定期血糖儀檢測大鼠血糖變化。
　　4) EIISA法檢測褪黑素、糖化血紅蛋白、血脂變化。
　　5)動脈組織超氧化物生成量、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）測定。
　　6)動脈組織免疫組化檢測caspase3表達。
　　7) Westernblot檢測促凋亡或抑制凋亡標志蛋白，Notch1/Hes1及JAK2/STAT3通路蛋白表達。
　　8)檢測細胞活

6、力（MTT法）。
　　9) TUNEL法檢測細胞凋亡。
　　研究結(jié)果：
　　1)在糖尿病動物實驗中，褪黑素明顯改善糖尿病大鼠血糖，減輕體重，降低糖化血紅蛋白、降低血脂，從而減輕糖尿病損傷。
　　2)在糖尿病動物實驗中，檢測胸主動脈組織的超氧化物生成量、丙二醛（MDA）水平、gp91phox蛋白表達量及超氧化物歧化酶（SOD）含量，發(fā)現(xiàn)褪黑素處理組（DM+Mel）較糖尿病組（DM），明顯改善，證實了褪黑素在糖尿病大

7、血管損傷中，發(fā)揮顯著抗氧化應激作用。
　　3)在糖尿病動物實驗中，與糖尿病組（DM）相比，褪黑素處理組（DM+Mel）中Notch1、Hes1、JAK2及STAT3蛋白表達明顯升高。另外，與（DM+Mel）褪黑素處理組相比，糖尿病組（DM）促凋亡蛋白caspase3及Bcl2表達過多，抗凋亡蛋白 Bax表達減少。胸主動脈組織的免疫組化結(jié)果為糖尿病組（DM）caspase3蛋白陽性明顯。因此我們懷疑褪黑素可激活Notch1/Hes1

8、和JAK2/STAT3信號通路，發(fā)揮抗凋亡作用。
　　4)為了進一步印證在動物實驗的假設，我們采用組織貼壁法培養(yǎng)原代平滑肌細胞。血管組織塊貼壁培養(yǎng)瓶中7天后，看見組織塊周圍呈放射狀爬行平滑肌細胞。30天后大量平滑肌細胞鋪滿培養(yǎng)瓶，重疊排列或者放射排列，呈“蜂窩”狀。單個細胞呈長梭形，兩端細長。
　　5)在高脂高糖環(huán)境中，予50mmol/L、100mmol/L及200mmol/L褪黑素處理，細胞活力呈一定梯度上升。并且隨著褪黑

9、素濃度升高，細胞凋亡率明顯減低。此外，與HG/HF組相比，褪黑素處理組（HG/HF+Mel）gp91phox蛋白表達量顯著下降（P＜0.01）。此外，超氧化物歧化酶結(jié)果趨勢相同。上述結(jié)果均說明在高脂高糖損傷過程中，褪黑素對平滑肌起保護及抗氧化應激損傷。
　　6)為明確在細胞水平層面，高脂高糖環(huán)境中褪黑素對 Notch1/Hes1及 JAK2/STAT3信號的影響，因此檢測Notch1、Hes1、JAK2和STAT3蛋白表達。與HG

10、/HF組相比，褪黑素處理組（HG/HF+Mel）Notch1、Hes1、JAK2和STAT3蛋白表達均顯著增加（P＜0.01）。為探究在高脂高糖條件下，褪黑素對平滑肌細胞凋亡的影響，我們檢測發(fā)現(xiàn)較褪黑素處理組，HG/HF組顯著地升高了促凋亡蛋白Caspase3和Bax水平，降低抗凋亡蛋白Bcl2（P＜0.01）水平。我們發(fā)現(xiàn)在在細胞水平層面，高脂高糖環(huán)境中，褪黑素對Notch1/Hes1及JAK2/STAT3信號通路、凋亡通路作用與動物

11、實驗結(jié)果是一致的。
　　7)褪黑素通過激活Notch1/Hes1及JAK2/Stat3信號抗高脂高糖損傷。細胞實驗結(jié)果，與HG/HF相比較，予DAPT或AG490組差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05），但較褪黑素處理組（HG/HF+Mel）相比，可見凋亡明顯增加。檢測超氧化物、gp91phox、Notch1/Hes1及 JAK2/Stat3信號通路蛋白表達量。我們發(fā)現(xiàn)褪黑素處理組（HG/HF+Mel）與HG/HF組、HG/HF+Mel+

12、DAPT組及HG/HF+Mel+AG490組相比，超氧化物及gp91phox明顯減低。予DAPT組與褪黑素組相比，Notch1、Hes1、JAK2及STAT3蛋白表達顯著降低（P＜0.01），然而與AG490組相比較，Notch1及 Hes1蛋白表達明顯下降（P＜0.01），但 JAK2及 STAT3蛋白表達未見差異（ P＞0.05）。褪黑素處理組與 HG/HF組、HG/HF+Mel+DAPT組及HG/HF+Mel+AG490組相比,促

13、凋亡蛋白caspase3及Bax均下降，抗凋亡蛋白Bcl2均上調(diào)。上述結(jié)果均提示，在高脂高糖環(huán)境下，明確了褪黑素通過 Notch1/Hes1與 JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮抗氧化應激與抗凋亡作用，而且 Notch1/Hes1與JAK2/STAT3信號通路互為上下游關(guān)系。
　　研究結(jié)論：
　　1)本研究證實了褪黑素對糖尿病引起的血管平滑肌損傷具有明確保護作用。
　　2)證實了褪黑素可通過激活Notch1/Hes1與J