腺病毒載體介導(dǎo)的shRNA沉默人心房肌細(xì)胞GIRK4基因的實驗研究.pdf

1、第一部分:編碼人GIRK4基因的shRNA序列篩選及腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
　　實驗一：人GIRK4的shRNA真核表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建
　　目的：構(gòu)建編碼人GIRK4的shRNA真核表達(dá)載體質(zhì)粒，為利用基因沉默技術(shù)從轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行GIRK4的研究做準(zhǔn)備。
　　方法：根據(jù)人GIRK4序列設(shè)計并合成四組shRNA寡核苷酸片段，退火形成雙鏈并克隆進(jìn)入載體pGCsi-U6，并進(jìn)行PCR鑒定和測序。
　　結(jié)果：PCR證明構(gòu)建的

2、shRNA已插入載體，經(jīng)測序證明與與設(shè)計的相同，獲得人GIRK4的shRNA表達(dá)載體質(zhì)粒（pGCsi-GIRK4-shRNA-U6）。
　　結(jié)論：構(gòu)建的GIRK4的shRNA真核表達(dá)載體可進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)短發(fā)夾RNA，經(jīng)Dicer酶裂解成siRNA并降解靶基因mRNA，而達(dá)到基因干擾的作用，為利用其進(jìn)行GIRK4功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　實驗二：人GIRK4的真核表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建
　　目的：構(gòu)建編碼人GIRK4真

3、核表達(dá)載體質(zhì)粒，為進(jìn)行人GIRK4的shRNA序列的篩選作準(zhǔn)備。
　　方法：以購買的人GIRK4基因為模板，PCR其cDNA編碼序列并克隆進(jìn)入載體pEGFP－C1，并進(jìn)行PCR鑒定、測序及轉(zhuǎn)染293細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察。
　　結(jié)果：PCR證明cDNA已插入載體，經(jīng)測序證明與與設(shè)計的相同，獲得人GIRK4融合蛋白的表達(dá)載體質(zhì)粒（pEGFP-GIRK4-C1），并能轉(zhuǎn)染293細(xì)胞表達(dá)融合蛋白。
　　結(jié)論:構(gòu)建的人GIRK

4、4真核表達(dá)載體可進(jìn)入哺乳細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GIRK4－EGFP融合蛋白，為進(jìn)行針對GIRK4基因RNA干涉序列篩選打下基礎(chǔ)。
　　實驗三：人GIRK4基因RNA干涉序列的篩選
　　目的：RNA干擾是基因技術(shù)的重要進(jìn)展，人們可以在轉(zhuǎn)錄后水平減少基因的表達(dá)。對RNAi是否有效而言，基因靶序列的選擇是至關(guān)重要的因素。我們研究了外源表達(dá)系統(tǒng)中（HEK293cell）GIRK4-shRNA沉默GIRK4基因表達(dá)的有效性及選擇高效的干涉序列。<

5、br>　　方法：將已構(gòu)建的四個靶向GIRK4基因的不同區(qū)域GIRK4的shRNA表達(dá)載體質(zhì)粒（pGCsi-GIRK4-shRNA-U6）、對照質(zhì)粒分別與與人GIRK4的真核表達(dá)載體質(zhì)粒（pEGFP-GIRK4-C1）共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞，進(jìn)行Westernblotting檢測。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染48小時之后，與對照組相比，四個不同序列的shRNA表達(dá)載體質(zhì)粒（pGCsi-GIRK4-shRNA-U6）使GI

6、RK4蛋白表達(dá)在48小時分別減少78.1％、85.3％、88.3％、94.3％，其中以4＃載體序列是最有效的干涉序列，其序列為：GGCTGAGCAGAATGAAGAA。
　　結(jié)論：成功地在外源表達(dá)系統(tǒng)篩選出高效的針對人GIRK4基因的高效RNA干涉序列。
　　實驗四：重組腺病毒載體Ad-GIRK4-shRNA的構(gòu)建及鑒定
　　目的：利用AdMax腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒載體Ad-GIRK4-shRNA并在293細(xì)胞

7、中擴(kuò)增制備重組腺病毒載體。
　　方法：人工合成針對GIRK4的4＃高效干涉序列,將其克隆到pDC316-EGFP-U6載體中，將pDC316-GIRK4-shRNA-EGFP-U6載體和骨架病毒pBHGlox_E1,3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝成重組的病毒顆粒，并進(jìn)行PCR鑒定和測序。
　　結(jié)果：經(jīng)PCR鑒定和測序，證實成功地構(gòu)建了攜帶人GIRK4的4＃高效干涉序列重組腺病毒載體(Ad-GIRK4-shRNA)并制備出高滴

8、度重組病毒。
　　結(jié)論：成功地構(gòu)建了攜帶人GIRK4shRNA片段的重組腺病毒載體(Ad-GIRK4-shRNA)，為進(jìn)一步進(jìn)行GIRK4的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分:人心房肌細(xì)胞培養(yǎng)
　　目的：培養(yǎng)出一定數(shù)量和具有良好狀態(tài)的人心房肌細(xì)胞。
　　方法:聯(lián)合運(yùn)用Ⅰ型膠原酶和ⅩⅣ型蛋白酶消化人右心耳的標(biāo)本，并利用差
　　速貼壁法消除大部分非心肌細(xì)胞，并利用actin抗體進(jìn)行免疫組化鑒定。
　　結(jié)果：成

9、功培養(yǎng)出一定數(shù)量人心房肌細(xì)胞，經(jīng)actin抗體鑒定90％以上均為心肌細(xì)胞。
　　結(jié)論：成功培養(yǎng)出人心房肌細(xì)胞，為今后進(jìn)行下一步實驗打下了基礎(chǔ)。
　　第三部分:腺病毒介導(dǎo)的Ad-GIRK4-shRNA對人心房肌細(xì)胞GIRK4干涉的實驗研究
　　目的和背景：心房顫動是臨床上最常見的心律失常之一,其與迷走神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)；心臟迷走神經(jīng)通過釋放的乙酰膽堿，作用于心房M2受體-G蛋白-IKACh通路，激活I(lǐng)KACh。GIRK4是

10、IKACh的功能亞單位,基因敲除的GIRK4小鼠不能誘發(fā)房顫。本實驗通過將腺病毒介導(dǎo)的GIRK4shRNA導(dǎo)入人心房肌細(xì)胞，觀察在人心房肌細(xì)胞進(jìn)行RNA干涉GIRK4的問題、可行性及對迷走神經(jīng)通路上的GIRK1、M2AChR表達(dá)及IKACh電流密度的影響，為今后將RNA干涉技術(shù)引入心律失常機(jī)制的研究及基因治療提供新思路和初步經(jīng)驗。方法：將重組腺病毒載體Ad-GIRK4-shRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的人心房肌細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染后不同時間的細(xì)胞，利用RT

11、-PCR、蛋白印跡來檢測GIRK4、GIRK1、M2AChR的表達(dá)及用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)來檢測IKACh、IK1電流密度的變化。結(jié)果：Ad-GIRK4-shRNA在MOI20對人心房肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率即達(dá)到95％以上；在mRNA水平和蛋白水平降低了GIRK4的表達(dá)，呈現(xiàn)出劑量依賴性和時間依賴性：MOI為5,20,50時，Ad-GIRK4-shRNA干涉效率分別為15.1％,35.2％,51.1％（P<0.05）；與空病毒感染組相比較，Ad-G

12、IRK4-shRNA感染人心房肌細(xì)胞后GIRK4mRNA表達(dá)水平分別為在24h、48h、96h分別為50.9％、14.7％、98.1％。Ads-GIRK4-shRNA在mRNA水平和蛋白水平分別使GIRK1表達(dá)降低了27.9％,20.2％（P<0.05）；使M2AChR的表達(dá)增加了19.6％,18.6％（P<0.05）。Ad-GIRK4-shRNA對IK1的電流密度無影響（P>0.05），使IKACh的電流密度下降了53％（P<0.05