關(guān)于Runx2基因突變、表達(dá)調(diào)控和主要編碼蛋白異構(gòu)體功能差異的研究.pdf

1、背景：骨質(zhì)疏松癥是目前最影響人們生活質(zhì)量的骨代謝性疾病之一，已證實(shí)骨質(zhì)疏松的發(fā)病主要是成骨細(xì)胞生成減少，成骨過程活動(dòng)相對(duì)減弱所致，而RUNX2是決定成骨細(xì)胞增殖分化及骨質(zhì)生成的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。人Runx2基因多種形式的突變(包括缺失、插入、倒置突變等)與一種常染色體顯性遺傳病鎖骨顱骨發(fā)育不全綜合癥(cleidocranial dysplasia，CCD)密切相關(guān)，表現(xiàn)為全身的軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨障礙。Runx2基因在人體主要翻譯表達(dá)二種

2、蛋白異構(gòu)體，Runx2-type Ⅰ(起始于P2啟動(dòng)子)和Runx2-typeⅡ(起始于P1啟動(dòng)子)，有研究顯示二者N'端的氨基酸序列有差異，在體內(nèi)翻譯表達(dá)的時(shí)間及組織分布水平也有差異，但關(guān)于二者在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)向成骨細(xì)胞分化過程中是否同樣存在功能差異至今尚不明確。新近認(rèn)為，植物雌激素可作為類雌激素的新型替代藥物治療婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松疾病，其中白黎蘆醇/金雀異黃酮尤其具有良好的功效，但具體作用機(jī)制尚不明確，本文擬采用

3、hBMSCs細(xì)胞模型，明確Runx2是否參與白黎蘆醇/金雀異黃酮的促骨質(zhì)生成效應(yīng)并探索有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一群具備多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，在特定條件下可以向成骨細(xì)胞分化，是研究成骨細(xì)胞分化和骨質(zhì)生成的重要模型，也是臨床上治療骨組織損傷的重要細(xì)胞來源，但原代hBMSCs在骨髓中含量極低且生命周期有限，因此建立永生化hBMSCs細(xì)胞株可為有關(guān)的研究提供豐富的細(xì)胞來源。 方法：(1)將猿猴病毒40大小T抗原穩(wěn)定

4、轉(zhuǎn)入原代hBMSCs建立永生化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系，檢測(cè)細(xì)胞的生命周期，生長曲線及多向分化能力，并通過免疫染色方法鑒定細(xì)胞的表面標(biāo)志。(2)采用hBMSCs為細(xì)胞模型，探索白黎蘆醇/金雀異黃酮對(duì)其向成骨細(xì)胞分化的影響并查明可能參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，檢測(cè)向成骨細(xì)胞分化過程中Runx2及其下游基因Osterix、Osteocalcin mRNA表達(dá)水平的變化(Real-Time PCR方法)、成骨特異性指標(biāo)ALP活性和細(xì)胞外鈣沉積量表達(dá)水平的

5、變化、MAPK通路蛋白pp44/42和pp38表達(dá)水平的變化(Westem blotting方法)。(3)通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的RNAi方法建立穩(wěn)定只表達(dá)單個(gè)RUNX2蛋白異構(gòu)體的永生化hBMSCs細(xì)胞株，檢測(cè)Runx2-type Ⅰ和Runx2-type Ⅱ在hBMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中mRNA表達(dá)水平的差異(Real-Time PCR方法)，并同步檢測(cè)多項(xiàng)成骨特異性指標(biāo)如ALP活性、細(xì)胞外鈣沉積量、骨鈣基因啟動(dòng)子表達(dá)水平的變化

6、。(4)對(duì)臨床收集的3個(gè)中國CCD家系的患者，提取基因組DNA后利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增Runx2基因的所有外顯子及P1、P2啟動(dòng)子序列，通過直接測(cè)序比對(duì)的方法探明是否存在突變，并對(duì)檢測(cè)到的突變?cè)隗w外進(jìn)行有關(guān)的功能學(xué)研究。 結(jié)果：(1)建立了永生化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞株，并證實(shí)其在保留了正常的細(xì)胞形態(tài)、生長曲線、細(xì)胞表面標(biāo)志和多向分化潛能的同時(shí)，獲得了無限繁殖的生命力；(2)促成骨細(xì)胞分化條件下，白黎蘆醇可顯著上調(diào)Runx

7、2及其下游基因Osterix、Osteocalcin的表達(dá)，且白黎蘆醇/金雀異黃酮均可刺激MAPK通路磷酸化p44/42和p38的表達(dá)顯著增加，p44/42MAPK通路抑制劑PD98059可削弱白黎蘆醇的促成骨細(xì)胞分化效應(yīng)，而p38MAPK通路抑制劑SB203580可削弱金雀異黃酮的促成骨細(xì)胞分化效應(yīng)。此外雌激素受體抑制劑ICI182780也可顯著降低白黎蘆醇/金雀異黃酮的促成骨細(xì)胞分化效應(yīng)；(3)Real-timePCR檢測(cè)結(jié)果顯示R

8、unx2-type Ⅰ主要在促成骨細(xì)胞分化早期起作用，可能與細(xì)胞增殖有關(guān)，Runx2-type Ⅱ主要在促成骨細(xì)胞分化晚期起作用，可能與細(xì)胞分化成熟有關(guān)；ALP活性、細(xì)胞外鈣沉積量和骨鈣基因啟動(dòng)子表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示Runx2-typeⅡ在促成骨細(xì)胞分化過程中的作用較Runx2-typeⅠ重要，尤其在促成骨細(xì)胞分化晚期；(4)在中國CCD家系中探得Runx2基因的2個(gè)單堿基突變，包括1個(gè)報(bào)道過的錯(cuò)義突變(577C>T)和1個(gè)新的

9、無義突變(240G>A)。體外研究證實(shí)，577C>T突變使RUNX2蛋白193位的精氨酸替換為中止密碼子(R255X)，產(chǎn)生截短的RUNX2蛋白(64：KD→30 KD)，并喪失對(duì)骨鈣基因啟動(dòng)子的激活潛能。 結(jié)論：(1)成功構(gòu)建了永生化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞株模型，從根本上解決了原代細(xì)胞短缺和老化問題，并能夠長期地為有關(guān)的研究提供豐富的同源性細(xì)胞來源；(2)證實(shí)了植物雌激素白黎蘆醇/金雀異黃酮對(duì)hBMSCs向成骨細(xì)胞分化有促進(jìn)作用，

10、且白黎蘆醇可通過刺激Runx2等成骨基因的表達(dá)及激活ER-p44/42MAPK通路產(chǎn)生促成骨細(xì)胞分化效應(yīng)，而金雀異黃酮可通過ER-p38MAPK通路實(shí)現(xiàn)這一效應(yīng)，這為指導(dǎo)臨床用藥防治骨質(zhì)疏松類疾病拓開新的思路；(3)首次應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的RNAi方法建立穩(wěn)定只表達(dá)單個(gè)RUNX2蛋白異構(gòu)體的永生化hBMSCs細(xì)胞株；(4)向國內(nèi)外首次提供有關(guān)Runx2-type Ⅰ和Runx2-type Ⅱ蛋白異構(gòu)體在hBMSCs向成骨細(xì)胞分化過程