膿毒癥小鼠腸道樹突狀細胞變化及其意義的研究.pdf

1、膿毒癥是外科危重癥病人的常見并發(fā)癥，由于其病理生理過程特別復雜牽涉全身各個器官，死亡率居高不下，是困擾外科和重癥監(jiān)護醫(yī)師的一大難題。近年的研究提示，免疫功能紊亂是造成膿毒癥治療困難和高致死率的重要原因。而樹突狀細胞作為免疫系統(tǒng)重要組成部分，其變化對了解膿毒癥機體免疫功能紊亂的發(fā)生和發(fā)展有重要意義。目前已有報道，膿毒癥可以造成脾臟、血液等處的樹突狀細胞丟失。然而，樹突狀細胞作為一族群，由于所定居的組織器官不同，性質(zhì)也不完全相同，因此，可以

2、推測膿毒癥過程中不同組織的樹突狀細胞的變化應(yīng)該也是不盡相同的。
　　 胃腸道是膿毒癥的重要受累器官。研究顯示在膿毒癥過程中定植于胃腸道內(nèi)的細菌及毒素極易發(fā)生易位，因此胃腸道又很有可能是膿毒癥患者發(fā)生二次感染甚至多器官功能衰竭的重要源器官。樹突狀細胞在腸道廣泛分布于腸粘膜固有層，Peyer's結(jié)等多處，通過多種途徑攝取腸腔內(nèi)的抗原。其對腸道免疫系統(tǒng)實現(xiàn)防御病原體侵襲的同時又可以避免病理性炎癥產(chǎn)生這一功能起了關(guān)鍵性的作用。但是目前對

3、于膿毒癥過程中腸道樹突狀細胞的改變的尚無研究。本研究觀察膿毒癥小鼠腸道樹突狀細胞的變化，并就可能的機制，及其對腸道炎癥以及膿毒癥治療的影響和意義進行了研究。
　　 腸道樹突狀細胞由于數(shù)目較少，分離檢測較為困難。因此本研究第一部分我們在國外文獻報道的基礎(chǔ)上進行改良，分別運用EDTA+DTT和膠原酶Ⅳ消化小鼠腸道組織，制得小鼠腸粘膜固有層和PP結(jié)的單細胞懸液，在用CD11c等抗體的標記后，進行流式分析儀分析，建立了較為穩(wěn)定的檢測腸道

4、樹突狀細胞的方法。本研究第二部分，我們用LPS腹腔注射的方法建立膿毒癥小鼠模型，運用第一部分建立的檢測方法，檢測了小鼠各時相點腸道樹突狀細胞的數(shù)目、成熟度以及亞型。同時，對比了外周血樹突狀細胞的檢測結(jié)果。此外還同時檢測各時相點TNF-α和IL-10的水平，以綜合評估各時相點炎癥狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠腸道樹突狀細胞的變化特征與血液及文獻報道的變化結(jié)果并不相同。LPS腹腔注射后，小鼠腸道樹突狀細胞數(shù)目在膿毒癥早期明顯增多，24小時后才開

5、始下降。LPS注射90分鐘后，腸道樹突狀細胞雖然增多，但成熟度的下降，CD86和MHCⅡ表達下調(diào)。而CD8+樹突狀細胞比例大幅度上調(diào)。外周血樹突狀細胞數(shù)目的變化趨勢與腸道樹突狀細胞的變化趨勢相反。在膿毒癥早期明顯下降而24小時后出現(xiàn)回升，72小時后甚至超過正常小鼠。對此，我們推測可能存在膿毒癥早期外周血樹突狀細胞向腸道的大量遷移。
　　 為驗證這一推測，第三部分我們分別檢測LPS刺激后CX3CR1-FKN和CCR6-MIP-3α

6、這兩對趨化因子及受體在腸道組織或骨髓源樹突狀細胞中表達的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS注射后腸道組織MIP-3α和FKN的表達上調(diào)。而體外實驗中骨髓源樹突狀細胞在LPS刺激后CX3XR1和CCR6的表達更是成百倍的上調(diào)。業(yè)已證實，F(xiàn)KN-CX3XR1和CCR6-MIP3α這兩對趨化因子及受體是介導樹突狀細胞遷移的重要趨化因子。因此，表明LPS刺激后樹突狀細胞的大量遷移是存在的。同時，為進一步了解遷移來的樹突狀細胞對于膿毒癥腸道炎癥反應(yīng)的影響，本研

7、究通過腹腔注射Flt3L，預(yù)處理小鼠，擴增樹突狀細胞的數(shù)目，進一步放大LPS注射后遷移入腸道的樹突狀細胞的數(shù)目，從而觀察腸道的炎癥反應(yīng)的改變。通過與生理鹽水預(yù)處理的小鼠比對，我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lt3L預(yù)處理小鼠注射LPS后，腸道炎癥反應(yīng)明顯加重。這些小鼠的腸道組織TNF-α水平，腸道病理改變都顯著嚴重于對照組。更為重要的是，實驗中經(jīng)Flt3L預(yù)處理小鼠在LPS注射后24小時全部死亡。此外還觀察到，F(xiàn)lt3L預(yù)處理腸道樹突狀細胞數(shù)目雖然明顯增多

8、，但其抵御腸道細菌易位的能力并沒有明顯增強。這一結(jié)果證明，樹突狀細胞，尤其由外周血遷移而來的樹突狀細胞是膿毒癥過程中腸道炎癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，其對炎癥反應(yīng)起了促進作用。并且，這一結(jié)果為下一部分實驗中膿毒癥免疫治療策略的制定提供了重要的依據(jù)。目前諸多研究表明，免疫功能的紊亂是造成膿毒癥病人二次感染、多器官功能衰竭甚至死亡的重要原因。動物實驗也發(fā)現(xiàn)給予免疫增強型的治療可以取得了較好的效果。我們的研究結(jié)果顯示，在膿毒癥的病理生理過程中存在

9、以過度的炎癥反應(yīng)為主要特點的階段，如果在這一階段或之前給予免疫增強治療將會不利于炎癥的控制和病人的預(yù)后。
　　 因此，在本研究的第四部分，根據(jù)前面所發(fā)現(xiàn)的膿毒癥小鼠腸道樹突狀細胞與炎癥及免疫系統(tǒng)變化的規(guī)律，相對應(yīng)的將相對應(yīng)的給予如下的免疫治療：在早期給予抑炎治療，后期開始加用免疫增強劑治療，并驗證其作用效果。我們分別選擇了樹突狀細胞數(shù)目達到高峰和開始出現(xiàn)丟失的拐點，即LPS注射后的3小時和24小時作為我們開始治療的時間點。分別選

10、擇地塞米松和胸腺肽α1作為抑炎治療和免疫增強治療制劑。通過比較不同給藥方式的小鼠，發(fā)現(xiàn)在LPS腹腔注射后3小時開始接受地塞米松注射，24小時開始加用胸腺肽α1的膿毒癥小鼠，受到二次感染的打擊后存活率仍達70％，并且這組小鼠抵御腸道細菌易位和二次感染的能力都強于其他給藥方式治療組。這一結(jié)果與樹突狀細胞數(shù)目的改變也直接相關(guān)。LPS注射12小時后，這組小鼠的腸道樹突狀細胞數(shù)目并沒有明顯增加，而后期也沒有出現(xiàn)明顯的丟失。表明這兩種藥物對膿毒癥過