晚期氧化蛋白產(chǎn)物對人血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子1表達(dá)的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究.pdf

1、研究背景 心血管疾病(CVD)是慢性腎臟病(CKD)患者最重要的死亡原因，占總死亡率的44％～51％，其病因由動(dòng)脈粥樣硬化(AS)導(dǎo)致的閉塞性血管病變又占半數(shù)以上。CKD患者已被認(rèn)為是心血管事件的“極高度危險(xiǎn)人群”。在導(dǎo)致CVD高發(fā)率的眾多原因中，CKD患者體內(nèi)普遍存在的高氧化應(yīng)激水平與AS之間的關(guān)系是近年來受到廣泛關(guān)注的研究領(lǐng)域。晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)是在尿毒癥患者血漿中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)氧化交聯(lián)產(chǎn)物，是氧化應(yīng)激過程中由激活的

2、中性粒細(xì)胞髓過氧化物酶產(chǎn)生的次氯酸(HClO)作用于蛋白質(zhì)而形成的，在體外用HClO作用于正常人血漿或純化的人血清白蛋白(HSA)亦可得到與尿毒癥病人血漿中類似的AOPP。AOPP本身也是一種新型的炎癥介質(zhì)，能誘導(dǎo)或加重氧化應(yīng)激。 內(nèi)皮位于血管壁和血流之間，能夠感知血液循環(huán)中的信號并做出相應(yīng)的反應(yīng)，它分泌血管活性物質(zhì)如一氧化氮(NO)、前列環(huán)素、內(nèi)皮素1、血管緊張素Ⅱ和活性氧(ROS)以調(diào)節(jié)血管舒縮功能，通過產(chǎn)生NO、黏附分子和

3、核因子-κB(NF-κB)促發(fā)炎癥反應(yīng)，通過分泌纖維蛋白原激活物、組織因子抑制劑、NO等影響凝血機(jī)制，還能夠影響細(xì)胞有絲分裂、血管形成、血管通透性和體液平衡等。因此，內(nèi)皮功能紊亂不僅導(dǎo)致血管舒張功能受損，而且與促炎癥和促血栓狀態(tài)有關(guān)，內(nèi)皮功能紊亂被認(rèn)為是AS形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)。研究證實(shí)，終末期腎病(ESRD)病人體內(nèi)積聚的氧化應(yīng)激產(chǎn)物與內(nèi)皮功能紊亂關(guān)系密切，服用維生素C后ESRD病人阻力血管的內(nèi)皮功能得到改善；在CRF動(dòng)物模型中，動(dòng)物體內(nèi)R

4、OS產(chǎn)生增加導(dǎo)致NO生物活性下降，內(nèi)皮損傷，這種損害能夠被抗氧化劑阻斷，提示氧化應(yīng)激是內(nèi)皮功能紊亂的重要誘因。氧化應(yīng)激等病理因素導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，內(nèi)皮功能紊亂，通透性增加，內(nèi)皮抗血栓活性喪失，而代之以促血栓作用。 由于AOPP與氧化應(yīng)激和炎癥的密切關(guān)系，提示AOPP很可能通過損傷內(nèi)皮功能介導(dǎo)AS的發(fā)展過程。研究證實(shí)，AOPP與AGE這兩類在氧化應(yīng)激或羰基化應(yīng)激過程中形成的大分子毒素，在結(jié)構(gòu)和生物活性上有許多相似之處。已有證據(jù)表明，A

5、GE通過細(xì)胞表面受體RAGE介導(dǎo)的p21ras依賴的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活NF-κB，誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，促使AS發(fā)生。我們以體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)作為血管內(nèi)皮細(xì)胞模型，觀察AOPP修飾的牛血清白蛋白(AOPP-BSA)對內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)表達(dá)的影響，并對其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行探討。 研究方法 一.無內(nèi)毒素AOPP修飾蛋白的制備 二.HUVECs的分離與培養(yǎng) 三

6、.細(xì)胞活力檢測 四.細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)水平測定 (一)ICAM-1蛋白合成的檢測 (二)ICAM-1蛋白表達(dá)的細(xì)胞定位 五.ICAM-1mRNA檢測 六.HUVECsMAPKs磷酸化的檢測 七.HUVECsNF-κB活性檢測 (一)免疫熒光化學(xué)染色法 (二)WesternBlotting (三)凝膠遷移分析(EMSA)法 八.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果

7、 一.AOPP-BSA的鑒定 制備的AOPP-BSA和未經(jīng)修飾的BSA的蛋白濃度分別為7.13mg/ml和10.3mg/ml，AOPP含量分別為32.68μmol/l和1.56μmol/l，經(jīng)蛋白濃度矯正后分別為4.58nmol/mg蛋白和0.15nmol/mg蛋白。 二.不同濃度AOPP-BSA對細(xì)胞存活的影響 結(jié)果顯示各AOPP-BSA處理組之間、AOPP-BSA處理組與對照組之間細(xì)胞活力差異無顯著性(

8、p＞0.05)。 三.AOPP-BSA對HUVECsICAM-1表達(dá)的影響 (一)內(nèi)皮細(xì)胞膜上和胞質(zhì)中均有ICAM-1蛋白表達(dá) (二)200μg/mlAOPP-BSA與HUVECs共同孵育3小時(shí)，其ICAM-1mRNA表達(dá)水平即顯著升高。 四.AOPP-BSA誘導(dǎo)HUVECsICAM-1表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究 (一)AOPP-BSA誘導(dǎo)HUVECsICAM-1表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 1

9、.NAD(P)H氧化酶參與AOPP-BSA上調(diào)HUVECsICAM-1表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 2.ERK1/2和p38參與調(diào)節(jié)AOPP-BSA誘導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)。 3.證實(shí)AOPP-BSA誘導(dǎo)NF-κB核遷移的作用，AOPP-BSA通過活化NF-κB上調(diào)HUVECsICAM-1表達(dá)。 4.AOPP-BSA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián) 為了闡明NAD(P)H氧化酶、ERK1/2、p38和NF-κB之間的相互關(guān)系，用各

10、個(gè)信號的特異性抑制劑預(yù)處理細(xì)胞，AOPP-BSA刺激后，檢測各個(gè)信號蛋白含量的變化。結(jié)果說明AOPP激活細(xì)胞內(nèi)信號分子，包括NAD(P)H氧化酶、ERK1/2、p38和NF-κB，這些信號分子之間并非各自獨(dú)立，而是形成信號級聯(lián)，調(diào)節(jié)ICAM-1的表達(dá)。 (二)AOPP-BSA誘導(dǎo)HUVECsICAM-1表達(dá)的受體途徑的研究，結(jié)果顯示AOPP-BSA上調(diào)ICAM-1表達(dá)的作用不能被這些抗體阻斷(加用抗體的各組與單用AOPP組相比，

11、p＞0.05)，提示AOPP-BSA誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)不通過受體RAGE、AGE-R1、AGE-R2、AGE-R3、CD36和LOX-1。 結(jié)論 一.AOPP可以時(shí)間和劑量依賴的方式上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1蛋白和mRNA的表達(dá)。由于AOPP對細(xì)胞活力沒有影響，說明AOPP對內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)作用并非由于細(xì)胞活力改變所致。 二.AOPP對內(nèi)皮細(xì)胞這一病理生物學(xué)效應(yīng)是通過激活氧化應(yīng)激敏感的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通