中國漢族人群Megsin基因變異與IgA腎病的關(guān)系及轉(zhuǎn)染Megsin基因?qū)w外系膜細(xì)胞增殖和分泌功能的影響.pdf

1、IgA腎病(IgA Nephropathy)是以腎小球系膜區(qū)IgA沉積為主要病理特征的一組原發(fā)性腎小球疾病，也是最常見的原發(fā)性腎小球腎炎和導(dǎo)致終末期腎病(End-Stage Renal Disease，ESRD)的主要病因之一。IgA腎病的發(fā)病機制至今尚未明了，從目前研究來看，遺傳因素、環(huán)境因素、免疫異常以及炎癥介質(zhì)失衡都與IgA腎病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中遺傳因素很可能在本病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。有證據(jù)顯示，IgA腎病是一種

2、多基因遺傳病(polygenic inheritancedisorders)，其發(fā)生、發(fā)展與多種基因變異有關(guān)，目前這些證據(jù)主要來自流行病學(xué)調(diào)查、家族性IgA腎病的發(fā)現(xiàn)、IgA腎病的家族聚集現(xiàn)象、動物模型的建立和相關(guān)基因或致病基因的發(fā)現(xiàn)等。 Megsin是一種腎臟系膜細(xì)胞優(yōu)勢表達基因，在IgA腎病、糖尿病腎病等以系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)積聚為主要病理改變的腎臟疾病中，其基因與蛋白表達水平均顯著上調(diào)，Megsin轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)

3、與人類．IgA腎病相似的腎臟病理改變。我們課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)，Megsin基因3'端非翻譯區(qū)C2093T和C2180T多態(tài)性與中國漢族人群IgA腎病的發(fā)生顯著相關(guān)。但這一相關(guān)分析的研究結(jié)果并不表明2093和2180就是Megsin基因真正的致病位點，這兩個位點也可能只是與真正的致病位點處于連鎖不平衡狀態(tài)，真正致病位點的確定還要依賴對Megsin基因各相關(guān)位點的進一步篩選和分析。 Megsin基因的發(fā)現(xiàn)雖然已有幾年，但對其生物

4、學(xué)功能及在腎臟疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用還知之甚少，我們課題組雖發(fā)現(xiàn)Megsin基因C2093T和C2180T多態(tài)性與中國漢族人群IgA腎病的發(fā)生有關(guān)，但對該變異與漢族人群IgA腎病的臨床表現(xiàn)及預(yù)后的關(guān)系并不清楚，對Megsin基因的生物學(xué)功能以及它如何促進腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展也很不了解，這也是我們想在下面的實驗中進一步探討的問題。 我們將繼續(xù)應(yīng)用以家庭為基礎(chǔ)(Falnily-based Studies)的關(guān)聯(lián)分析方法——單倍型相對

5、危險度(haplotype relative risk，HRR)分析和傳遞／不平衡分析(transmission／Disequilibrium Test，TDT)，對Megsin基因與IgA腎病發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的多態(tài)性位點進行篩選，希望能盡早發(fā)現(xiàn)真正的致病位點。同時通過基因轉(zhuǎn)染、體外系膜細(xì)胞培養(yǎng)等方法，了解Megsin基因過度表達對體外系膜細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)積聚的影響和機制。 實驗一、中國漢族人群Megsin基因變異與lgA腎病

6、的相關(guān)關(guān)系 1．中國漢族人群Megsin基因變異與部分多態(tài)性位點的鑒定和初步篩選 [目的]通過比較基因庫中高加索人群的遺傳資料，了解中國漢族人群Megsin基因變異，初步篩選適合做進一步相關(guān)分析的多態(tài)性位點。[方法]根據(jù)基因庫中的遺傳資料，挑選Megsin基因不同功能域的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)和直接測序的方法，鑒定IgA腎病患者和正常對照者各位點基因型，

7、計算各位點雜合度，根據(jù)雜合度大小和疾病組與正常對照組雜合度的差異，篩選適合做進一步相關(guān)分析的多態(tài)性位點。[結(jié)果]在12個從基因庫中挑選的SNP位點中，有6個在我國漢族人群未發(fā)現(xiàn)具有多態(tài)性，另外6個證實有多態(tài)性，在第5內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)兩個新的SNP位點。在8個多態(tài)性位點中，1個屬少見多態(tài)，5個屬常見多態(tài)，各SNP位點的雜合度在IgA腎病組和正常對照組差異無顯著性(P>0.05)。[結(jié)論]中國漢族人群的Megsin基因與基因庫中高加索人群相比存在

8、較大差異，可能與中國漢族人群對IgA腎病的高易感性具有重要聯(lián)系。 2．Megsin基因與中國漢族人群IgA。腎病的發(fā)生相關(guān)多態(tài)性位點篩選 [目的]篩選Megsin基因與中國漢族人群IgA腎病的發(fā)生相關(guān)多態(tài)性位點，為致病位點的確定積累依據(jù)。[方法]收集中國漢族人群IgA。腎病家系的血液或唾液標(biāo)本并提取基因組DNA，應(yīng)用PCR-RFLP或直接測序的方法鑒定各篩選位點基因型，通過TDT和HRR分析了解各目標(biāo)位點與IgA腎病發(fā)生

9、的關(guān)系。[結(jié)果]TDT和HRR分析顯示，Megsin基因23167位點G等位基因從雜合子父母過度傳遞給患病子女，Megsin C25663G、23179 9T/10T、T23381C和C23415T位點各等位基因的傳遞無顯著傾向性。[結(jié)論]Megsin基因A23167G多態(tài)性與中國漢族人群IgA腎病的發(fā)生顯著相關(guān)，而Megsin C25663G、23179 9T/10T、T23381C和C23415T多態(tài)性與中國漢族人群IgA腎病的發(fā)生

10、無關(guān)。 3．中國漢族人群Megsin基因2093C-2180T與lgA腎病患者臨床、病理和預(yù)后的關(guān)系 [目的]了解Megsin基因C2093T和C2180T多態(tài)性與中國漢族人群IgA腎病患者臨床表現(xiàn)、腎組織病理改變和預(yù)后的關(guān)系。[方法]收集中國漢族IgA腎病患者臨床和病理資料，隨訪病人，根據(jù)病情是否穩(wěn)定、血壓、24小時尿蛋白、腎組織學(xué)改變的Lee’S分級分別對患者進行分組，計算并比較各組Megsin基因C2093T-C2

11、180T單倍型分布頻率的差異。[結(jié)果]在IgA腎病進展組和穩(wěn)定組、高血壓組和非高血壓組、24hUP≥2g/d組和24hUP<2g/d組及不同程度病理改變組之間，Megsin基因C2093T—C2180T四種單倍型分布頻率的差異均有顯著性(P<0.05)。其中2093C-2180T在病情進展組、高血壓組、24hUP≥2g/d組和腎組織病理分級Lee'S IV+V組的分布頻率顯著高于其相應(yīng)對照組(P<0.05)。[結(jié)論]Megsin基因C2

12、093T和C2180T多態(tài)性與中國漢族人群IgA腎病患者腎組織病理改變和臨床表現(xiàn)顯著相關(guān)，單倍型2093C-2180T的過度傳遞與嚴(yán)重腎組織病理損害、高血壓、大量蛋白尿和病情進展顯著相關(guān)。 實驗二、轉(zhuǎn)染Megsin基因?qū)w外系膜細(xì)胞增殖和分泌功能的影響 [目的]了解Megsin基因高表達對體外系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)積聚的影響并初步探討其機制。[方法]構(gòu)建Megsin基因真核表達載體，體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞，應(yīng)用<'

13、3>H-胸腺嘧啶(<'3>H-TdR)摻入法檢測系膜細(xì)胞增殖情況、RT-PCR和ELISA法檢測系膜細(xì)胞PDG-BB、IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β<,1>和TNF-a mRNA的表達及細(xì)胞培養(yǎng)上清PDGF-BB、TGF-β<,1>和Ⅳ型膠原的分泌水平。檢測PDGF-BB中和抗體對大鼠系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染Megsin基因后細(xì)胞增殖和TGF-β<,1> mRNA表達的影響。[結(jié)果]大鼠系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染Megsin基因后細(xì)胞內(nèi)<'3>H-

14、TdR的摻入量顯著增加，PDGF-BB和TGF-β<,1> mRNA的表達顯著上調(diào)，細(xì)胞培養(yǎng)上清PDGF-BB、TGF-β<,1>和Ⅳ型膠原的濃度顯著升高，且三者與轉(zhuǎn)染Megsin基因呈明顯時間依賴性關(guān)系。PDGF-BB中和抗體可顯著抑制系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染Megsin基因后細(xì)胞的增殖反應(yīng)，下調(diào)胞TGF-β<,1> mRNA的表達。轉(zhuǎn)染Megsin基因?qū)ο的ぜ?xì)胞IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α mRNA的表達無顯著影響。 [結(jié)論]

15、Megsin基因高表達在體外可顯著促進大鼠系膜細(xì)胞增殖和Ⅳ型膠原分泌，細(xì)胞PDGF-BB和TGF-β<,1>的表達、分泌顯著升高。其中PDGF-BB表達、分泌的升高對系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞TGF-β<,1>的表達具有顯著促進作用。 總結(jié)： 根據(jù)以上研究結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)： 1．中國漢族人群Megsin基因變異與高加索人群存在較大差別，可能與中國漢族人群對IgA腎病的高易感性具有重要聯(lián)系。 2．中國漢族人群M

16、egsin基因A23167G多態(tài)性與IgA腎病的發(fā)生顯著相關(guān)，其中G等位基因存在從父母到IgA腎病患者的過度傳遞。Megsin C25663G、23179 9T／10T、T23381C和C23415T多態(tài)性與中國漢族人群IgA腎病的發(fā)生無關(guān)。 3．Megsin基因C2093T和C2180T多態(tài)性與中國漢族人群IgA腎病患者腎組織病理改變和臨床表現(xiàn)顯著相關(guān)，單倍型2093C-2180T的過度傳遞與患者腎組織嚴(yán)重病理損害、高血壓、大