全氟辛烷磺酸(PFOS)對(duì)小鼠免疫毒性效應(yīng)研究.pdf

1、全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonate，PFOS)是近年來引起科學(xué)家們關(guān)注的一種新型持久性有機(jī)化合物，該有機(jī)物被廣泛用于機(jī)械潤滑劑、涂料、農(nóng)藥和醫(yī)藥品、表面活性劑、紡織品和皮革制品表面防污劑、泡沫滅火劑等數(shù)百種工業(yè)和日用品生產(chǎn)領(lǐng)域。由于PFOS在自然界中的難降解性和生物體內(nèi)的高蓄積性，其已經(jīng)在生態(tài)系統(tǒng)中得到廣泛的傳播，并且正在通過食物鏈途徑的生物濃縮和生物放大進(jìn)行生物種群間的轉(zhuǎn)移，最終高濃度地蓄積在食物鏈高位生

2、物包括食肉動(dòng)物和人體內(nèi)。2004年杜邦公司“不粘鍋事件”進(jìn)一步引起了國內(nèi)專家對(duì)PFOS的關(guān)注。 PFOS分子是由17個(gè)氟原子和8個(gè)碳原子組成的烴鏈，烴鏈末端碳原子上連接一個(gè)磺?；?。這種化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使分子中烴鏈碳原子間的共價(jià)鍵不容易受到外界作用而產(chǎn)生斷裂。研究資料表明，PFOS即使在濃硫酸或濃硝酸溶液中煮沸1小時(shí)也不分解，或在98％硫酸中經(jīng)過28天PFOS濃度也未見任何降低。與以往持久性有機(jī)污染物不同，PFOS具有疏水、疏油脂特

3、性，雖然同屬于持久性有機(jī)污染物，但是不蓄積在脂肪組織中，大部分與血漿蛋白結(jié)合存在于血液中，其余分布在動(dòng)物肝臟、少量分布于肌肉和腦等其它組織中。研究表明，生物體內(nèi)的PFOS主要來自食物、飲水、含PFOS泡沫滅火劑氣溶膠吸入或體內(nèi)含PFOS系列產(chǎn)品的降解。有研究表明，一個(gè)70kg體重的成年人通過飲食每天攝入PFOS的量約為62.5～74.2ng。人群血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，各國各族人群血清中均檢測(cè)出不同濃度的PFOS污染，其中職業(yè)暴露人群血清

4、中PFOS濃度高達(dá)12.83mg/L；甚至新生兒血清中也存在PFOS污染。最近研究結(jié)果顯示，人類血清中PFOS生物半衰期平均為8.67年(范圍為2.29～21.3年，SD=6.12)，最高達(dá)21.3年。而更值得關(guān)注的是，人體內(nèi)PFOS負(fù)荷呈逐年增高趨勢(shì)。日本學(xué)者的調(diào)查結(jié)果顯示，在1983～1999年期間，人群血清中PFOS濃度以每年0.49 ug/L速度遞增。我國沈陽地區(qū)人群血清PFOS濃度從1987年的0.03ug/L增加到2002年

5、的22.4ug/L，15年間人群血清中PFOS濃度增加了747倍。 PFOS的大鼠一次經(jīng)口半數(shù)致死劑量(LD50)為251mg/kg，按照WHO定義標(biāo)準(zhǔn)，PFOS應(yīng)屬于中等毒性物質(zhì)。人群流行病學(xué)調(diào)查顯示，PFOS可降低新生兒體重，并使職業(yè)人群患膀胱癌和前列腺癌的危險(xiǎn)性增高。毒理學(xué)研究表明，PFOS可對(duì)機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生損傷，并具有胚胎發(fā)育毒性和遺傳毒性，表明PFOS可能為一種全身毒性物質(zhì)。免疫系統(tǒng)是對(duì)外源

6、性化合物最為敏感的系統(tǒng)之一，但是，目前對(duì)于PFOS材料引起的免疫毒性研究剛剛起步，資料甚少，現(xiàn)有的為數(shù)不多的研究主要集中在PFOS對(duì)某些有限的免疫指標(biāo)的毒性效應(yīng)上，而關(guān)于PFOS免疫毒性的系統(tǒng)研究未見報(bào)道。所以，全面研究PFOS的免疫毒性，了解PFOS對(duì)免疫系統(tǒng)的危害，闡明PFOS免疫毒性劑量—效應(yīng)關(guān)系和毒作用機(jī)制，可使人們深入了解PFOS危害性，在PFOS環(huán)境安全性評(píng)價(jià)中提供科學(xué)依據(jù)。因此，本研究在觀察PFOS短期染毒、亞慢性染毒和體

7、外染毒對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)毒性的基礎(chǔ)上，應(yīng)用ELISA、流式細(xì)胞分析等方法進(jìn)一步探討PFOS對(duì)小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫、非特異性免疫等的影響，從分子水平上評(píng)價(jià)PFOS對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)毒性效應(yīng)。 材料與方法： 一、試驗(yàn)動(dòng)物染毒方式和樣品制備 1、PFOS配制方法： 試驗(yàn)組配制：配制2％ Tween80溶液，按照設(shè)計(jì)劑量加入全氟辛烷磺酸鉀鹽(PFOS—K)配制PFOS溶液。對(duì)照組配制：配制2％ Tween80溶液。

8、 2、短期染毒 8—10周的雄性C57BL/6小鼠48只，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后按體重隨機(jī)分為4組，每天一次經(jīng)口灌胃染毒，試驗(yàn)組每天PFOS染毒劑量分別為5、20、40mg/kg(bw)，對(duì)照組給予2％ Tween—80。每天一次經(jīng)口灌胃染毒7天。 3、亞慢性染毒 將8—10周的雄性C57BL/6小鼠60只，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)10天后按體重隨機(jī)分為6組，每天一次經(jīng)口灌胃染毒60天，試驗(yàn)組60天PFOS累計(jì)染

9、毒劑量[Total Administered Dose(TAD)]分別為0.5、5、25、50、125mg/kg(bw)，即每天染毒劑量分別為8.33、83.33、416.67、833.33、2083.33μg PFOS/kg(bw)，對(duì)照組給予2％ Tween—80。 4、體外染毒 10周雄性C57BL/6小鼠6只，無菌取脾制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整脾細(xì)胞終濃度至1×107/mL，取200μl/孔加入24孔培養(yǎng)板中。將PFO

10、S(以DMSO為溶劑)按0、1、5、10、50、200、300μM的濃度加入24孔培養(yǎng)板中，37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)，提取培養(yǎng)上清，檢測(cè)細(xì)胞因子水平。 5、脾細(xì)胞采集 短期染毒后第8天或亞慢性染毒第61天，摘除眼球采血并收集血清，頸椎脫位處死小鼠，75％酒精浸泡，取出各組小鼠的胸腺、腎臟、肝臟、脾臟，稱量質(zhì)量，并計(jì)算器官指數(shù)。常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，用含2％熱滅活FCS的PBS將脾細(xì)胞終濃度調(diào)至1×107

11、/mL。 二、免疫指標(biāo)測(cè)定方法 1、血清中PFOS濃度測(cè)定 2、CD4+、CD8+細(xì)胞亞群檢測(cè) 3、NK細(xì)胞活性檢測(cè) 4、MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖 5、NO測(cè)定 6、B細(xì)胞溶血空斑試驗(yàn)測(cè)定 7、ELISpot法檢測(cè)IL—2和IL-10細(xì)胞數(shù)量 8、ELISA法細(xì)胞因子IL—2、IL—4、IL-10、IFN—γ測(cè)定 9、血清抗體IgG、IgM測(cè)定 采用

12、ELISA檢測(cè)血清抗體水平：100μl/孔標(biāo)準(zhǔn)品加入到96孔酶標(biāo)板中，每孔加入100μl血清，加入50μl/孔酶標(biāo)記溶液，36℃孵育1h，每孔加入底物呈色劑A、B液各50μ1，36℃孵育15min，加入50μl/孔終止液。于450nm酶標(biāo)儀讀取OD值。 10、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后，用均數(shù)(Mean)和標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)描述正態(tài)分布數(shù)據(jù)的描述指標(biāo)。各組數(shù)據(jù)之間比較采用單因素

13、方差分析，采用Dunnett()t檢驗(yàn)進(jìn)行各個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組的多重比較。 結(jié)論： 1、PFOS是與機(jī)體免疫反應(yīng)相關(guān)的外源性化學(xué)物質(zhì)，以5mg PFOS/kg劑量連續(xù)7天染毒小鼠時(shí)即可抑制小鼠免疫功能。 2、PFOS對(duì)C57BL/6小鼠經(jīng)口染毒60天可導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)的抑制，根據(jù)免疫指標(biāo)的改變，其未觀察到損害所用的劑量(NOAEL)和觀察到損害作用的最低劑量(LOAEL)分別為0.5mg/kg TAD和5mg/kg