α7N膽堿受體在非小細胞肺癌細胞侵襲遷移和EMT中的作用及信號途徑.pdf

1、煙堿型膽堿受體（nicotinic receptors,nAChR）廣泛分布于自主神經(jīng)節(jié)后和副交感神經(jīng)支配的效應器官和組織，發(fā)揮極為重要的生理學功能和藥理學作用。隨著非神經(jīng)源性膽堿系統(tǒng)和“膽堿能抗炎通路”認識的不斷發(fā)展，nAChR在細胞調控中的作用日益受到關注。nAChR的所有亞型中，α7 N膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）在包括肺癌在內的多種腫瘤組織中均有較高表達，而且

2、與尼古丁有高度親和力。尼古丁是煙草的主要成分之一，也是天然nAChR的激動劑。因而進一步闡明α7nAChR對肺癌細胞的調控及其相關信號通路將具有重要生物學和藥理學意義。
　　目前肺癌在全球的發(fā)病率和死亡率位居所有腫瘤前列。無論對于其發(fā)病因素還是死亡原因，吸煙都是其確定的高危因素，不僅能促使肺癌的發(fā)生，還在肺癌的惡變和轉移中起重要作用。業(yè)已證實，尼古丁可通過激動nAChR參與調控腫瘤細胞多種活動包括增殖、存活、凋亡、遷移等，促使腫瘤

3、細胞（包括肺癌細胞）的上皮間質化（epithelial mesenchymal transition，EMT）過程。然而，具有與尼古丁有高親和力的α7nAChR在非小細胞肺癌（NSCLC）的侵襲和EMT中的作用迄今未見明確報道，α7nAChR對尼古丁所致肺癌侵襲及EMT調控的細胞信號通路也尚未完全闡明。
　　本研究采用transwell熒光檢測、RT-PCR、Westernblot等技術研究了NSCLC中多種 nAChR亞型的表達

4、情況；同時，采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜（HPLC-ESI-MS/MS）的技術動態(tài)檢測NSCLC細胞是否存在自分泌內源性乙酰膽堿作用。分析了激動、阻斷或基因沉默α7nAChR所介導的尼古丁促NSCLC細胞侵襲作用；采用裸鼠接種技術研究α7nAChR對腫瘤的在體生長和侵襲功能；采用激光共聚焦、細胞免疫熒光、基因沉默、細胞高內涵等技術觀察激動、阻斷或基因下調α7nAChR對細胞形態(tài)、蛋白表達等EMT特征的作用，以及細胞EMT轉變與侵襲力

5、間的關系；采用Fluro4 AM鈣熒光探針、Westernblot檢測受體耦聯(lián)的鈣離子流信號變化以及受體依賴性細胞內信號轉導途徑。
　　研究結果表明：
　　1.在屬于NSCLC的A549、H1299及PC9細胞中，α7nAChR高表達于A549和H1299細胞，PC9細胞上未見α7nAChR表達。A549細胞培養(yǎng)上清液中檢測限以上未測到內源性乙酰膽堿。
　　2.尼古丁能明顯增強A549、H1299細胞的遷移侵襲能力，該

6、作用能被α7nAChR特異性阻斷劑α-銀環(huán)蛇毒（α-BTX）或基因沉默α7nAChR后所逆轉。
　　3.尼古丁能使細胞發(fā)生EMT，促使其表型由上皮樣轉變?yōu)殚g質樣細胞，同時使其胞漿內上皮、間質標志蛋白的表達發(fā)生改變。這一作用與α7nAChR上調、細胞侵襲力改變相關；阻斷α7nAChR，能使細胞侵襲力及間質蛋白Vimentin的表達發(fā)生劑量依賴性抑制，基因下調α7nAChR表達，尼古丁引起的細胞侵襲增強和EMT過程能明顯受到抑制。

7、r>　　4.將α7nAChR基因沉默的H1299細胞接種于裸鼠，再給予其尼古丁時，裸鼠體內接種的腫瘤細胞生長與侵襲受到明顯抑制。
　　5.細胞內PI3-K/AKT及 Ras-Raf-MEK-ERK通路以及細胞內Ca2+變化介導了α7nAChR調控的細胞內信號轉導途徑。
　　上述研究揭示了α7nAChR的活性調節(jié)可介導NSCLC細胞的侵襲力變化，并依賴于對NSCLC細胞EMT過程及間質蛋白表達量的調節(jié)；發(fā)現(xiàn)在NSCLC中α7n