尼克酰胺抑制胰島移植后IBMIR作用的研究.pdf

1、近年來我國(guó)糖尿病的發(fā)病率呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。對(duì)于嚴(yán)重危害人類尤其是年輕人健康的1型糖尿病(胰島素依賴型糖尿病)，目前主要采用外源性胰島素替代的治療方法?；颊卟粌H需要終生使用胰島素，而且經(jīng)常會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的低血糖反應(yīng)，甚至出現(xiàn)致命的低血糖昏迷。移植不但是目前根治此病的唯一方法，而且可以降低代謝不穩(wěn)定性以避免低血糖昏迷的發(fā)生，又可以防止多種遠(yuǎn)期的并發(fā)癥。近年來，全胰腺移植越來越多地被應(yīng)用于臨床，但它具有較多弊?。核且环N創(chuàng)傷性療法，目前仍有較高

2、的死亡率；它所應(yīng)用的免疫抑制方案常會(huì)引起嚴(yán)重的副反應(yīng)。而胰島移植長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是一種頗具吸引力的療法，它不僅操作簡(jiǎn)便，死亡率極低，又具有反復(fù)操作性。所以長(zhǎng)期以來，許多科研機(jī)構(gòu)都致力于此項(xiàng)研究。 盡管胰島移植在治療1型和部分2型糖尿病有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但其遠(yuǎn)期療效不夠理想，其主要原因包括(1)胰島分離過程中的物理化學(xué)因素：例如低溫，缺氧。(2)胰島移植早期即刻經(jīng)血液介導(dǎo)的炎性反應(yīng)(IBMIR)。(3)移植后機(jī)體對(duì)胰島細(xì)胞的免疫排斥反

3、應(yīng)。 目前研究表明，胰島移植早期常伴有大量胰島的丟失，這種現(xiàn)象被統(tǒng)稱為原發(fā)性無功能，而與免疫因素?zé)o關(guān)。除了胰島制備中內(nèi)在的固有質(zhì)量因素外，另外的一個(gè)重要原因就是新植入的胰島與血流接觸后所引發(fā)的反應(yīng)，被稱為即刻經(jīng)血液介導(dǎo)的炎癥(Instant blood mediated inflammatory reaction以下簡(jiǎn)稱IBMIR)，其反應(yīng)特征是血小板的激活和凝血系統(tǒng)以及補(bǔ)體系統(tǒng)的激活。 有證據(jù)表明，分離后的胰島細(xì)胞可以

4、合成TF(tissue factor)，而TF是引起外源性血液凝集反應(yīng)最重要的激活物。在臨床胰島移植中，胰島細(xì)胞一經(jīng)接觸受體的血液，產(chǎn)生的TF就會(huì)通過激活外源性凝血途徑導(dǎo)致血液的凝集反應(yīng)，從而導(dǎo)致IBMIR的發(fā)生。MCP-1(macrophage chemoattractant Protein)在人類胰島中也有表達(dá)，MCP-1對(duì)單核細(xì)胞有趨化活性作用并且胰島移植前該蛋白的水平同臨床胰島移植的愈后密切相關(guān)。TF作為外源性凝血途徑的起始物，

5、MCP-1作為誘導(dǎo)趨化因子所引起IBMIR的反應(yīng)有可能是臨床胰島移植低成功率以及需要不止一個(gè)供體才能使受體獲得正常的血糖水平的主要原因。 因此我們可以假設(shè)：在胰島的提純和分離過程中，胰島細(xì)胞的TF和MCP-1的表達(dá)可以被一些特殊物質(zhì)所抑制。在不同的供體所提供的胰島中，由個(gè)體差異所引起的TF和MCP-1在MRNA和蛋白質(zhì)階段不同的水平支持這種可能性。都知道生理學(xué)畸形經(jīng)常存在腦死亡的病人中，而且移植前的冷藏和組織缺氧能夠誘使各種促炎

6、性基因的表達(dá)。目前已經(jīng)有證據(jù)表明，尼克酰胺(一種B族維生素的衍生物)可以抑制TF和MCP-1在巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)[3]。因此在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中我們主要驗(yàn)證已經(jīng)被證明可以抑制單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中TF與MCP-1表達(dá)的尼克酰胺是否對(duì)胰島細(xì)胞有同樣的影響。應(yīng)用它對(duì)移植前的胰島細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理從而抑制IBMIR的發(fā)生。 材料與方法： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：普通級(jí)封閉群Wistar大鼠，雌雄不限，重量250-300g(購自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7、部)。實(shí)驗(yàn)第一部分：對(duì)照組：RPMI1640+胰島，實(shí)驗(yàn)組：RPMI1640+胰島+尼克酰胺；實(shí)驗(yàn)第二部分：實(shí)驗(yàn)組：尼克酰胺預(yù)處理過的胰島細(xì)胞500單位+RPMI1640 100ul+2ml全血。對(duì)照組：基礎(chǔ)培養(yǎng)的胰島細(xì)胞500單位+RPMI1640 100ul+2ml全血，空白對(duì)照組：RPMI1640 100ul+2ml全血。 胰島提取：向供鼠胰管內(nèi)原位逆行灌注膠原酶溶液(用冷的Hank's液配制，劑量為1.5mg/ml)10

8、-12ml，使胰腺充分膨脹。切取后在37±1℃水浴中振蕩消化，消化時(shí)間12-15 min。終止消化后，兩次離心洗滌，過80目篩。Ficoll梯度離心法純化胰島，濃度分別為25％、23％、20.5％和11％，離心后于23％和20.5％之間，及20.5％和11％之間交界處吸取胰島細(xì)胞，RPMI-1640洗滌兩次備用。獲取的胰島用雙硫腙染色來判斷所提胰島的純度，胰島細(xì)胞數(shù)=3次樣品中DTZ陽性細(xì)胞團(tuán)數(shù)÷3×20×樣本總量(ml)。丫啶橙/溴乙

9、啶(AO/EB)熒光染色法顯示細(xì)胞活率。 提純后的胰島細(xì)胞與50mM尼克酰胺在37℃ 5％CO2的保溫箱中共同培養(yǎng)48h。通過體外葡萄糖刺激下胰島素釋放試驗(yàn)檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下胰島活性并利用酶聯(lián)免疫方法測(cè)定混合培養(yǎng)后胰島細(xì)胞中TF與MCP1的含量。 體外模擬循環(huán)模型建立：該模型由長(zhǎng)度為390mm，直徑為6.3mm聚乙烯管構(gòu)成，將循環(huán)管的兩端通過三腔接頭連接，將相同的三個(gè)循環(huán)管固定置于擺動(dòng)器上，并放入37℃水浴箱中，通過擺動(dòng)

10、模擬體內(nèi)血液循環(huán)。 肝素化處理：將所有與大鼠血液相接觸的管道內(nèi)表面均涂以肝素，所用肝素濃度為0.5μg/cm2相當(dāng)于0.1unit/cm2。 血液制備：新鮮的大鼠血液被收集于肝素化的20ml的注射器中。 血液分析：反應(yīng)后的血液行血常規(guī)檢查，計(jì)數(shù)血小板，白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞數(shù)，并通過葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰島功能。 組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)：液基細(xì)胞學(xué)檢查檢測(cè)(TCT)，觀察胰島形態(tài)變化。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：將所

11、得數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。t檢驗(yàn)進(jìn)行處理，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.胰島提?。浩骄恐淮笫罂色@得約600IEQ胰島，經(jīng)DTZ染色后，純度>90％。胰島活率>98％。尼克酰胺混合培養(yǎng)48h后，體外葡萄糖刺激下胰島素釋放試驗(yàn)表明：對(duì)照組在低糖溶液中胰島素平均含量為57.8±6.79μIU/ml，高糖溶液中胰島素平均含量為199.45±14.80μIU/ml，釋放指數(shù)(SI)為3.47±0.40。實(shí)驗(yàn)組低糖溶

12、液中胰島素平均含量為58.5±7.38μIU/ml，高糖溶液中胰島素平均含量為184.39±23.47μIU/ml，釋放指數(shù)(SI)為3.24±0.26。對(duì)照組中TF含量為9.90±2.12pg/islet，MCP1含量為2.22±0.58 pg/islet，實(shí)驗(yàn)組中TF含量為1.42±0.42pg/islet，MCP1含量為0.33±0.13 pg/islet。 2.血液分析：對(duì)照組中血小板數(shù)分別為(n=10)258.1±82

13、.4×109/L、40.9±12.9×109/L、實(shí)驗(yàn)組血小板為232.5±73.5×109/L。對(duì)照組中白細(xì)胞數(shù)分別為9.05±0.98×109/L、4.54±0.92×109/L，實(shí)驗(yàn)組中白細(xì)胞為7.39±1.10×109/L。對(duì)照組中淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為73.5±9.8％、49.8±9.98％，實(shí)驗(yàn)組中淋巴細(xì)胞為68.6±10.34％。對(duì)照組中單核細(xì)胞數(shù)分別為0.52±0.16×109/L、0.30±0.12×109/L，實(shí)驗(yàn)組中

14、單核細(xì)胞0.4±0.15×109/L。 3.與血液接觸后胰島素刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果：對(duì)照組在低糖溶液中胰島素平均含量為24.24±6.22μIU/ml，高糖溶液中胰島素平均含量為49.02±16.14μIU/ml，釋放指數(shù)(SI)為1.98±0.29。實(shí)驗(yàn)組低糖溶液中胰島素平均含量為43.5±8.08μIU/ml，高糖溶液中胰島素平均含量為130.76±21.41μIU/ml，釋放指數(shù)(SI)為3.02±0.29。 4.TCT檢