MAFbx-Atrogin-1和MuRF1在大鼠肌肉游離移植模型中的表達(dá)和意義.pdf

1、本課題擬通過建立吻合血管神經(jīng)的游離肌肉移植動物模型，采用組織形態(tài)學(xué)、電生理、免疫組化、Real-time PCR、Western blot等方法，對MAFbx/Atrogin-1和MuRF1在大鼠肌肉游離移植模型中的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及其與肌肉萎縮狀況的相關(guān)性進行研究，從而為闡明肌肉移植后功能降低的潛在機制及防治肌肉的萎縮提供重要的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。 目的： (1)建立大鼠股薄肌原位游離移植的模型，并評測各項描述肌肉萎縮的相關(guān)

2、指標(biāo)； (2)觀測術(shù)后不同時段MAFbx/Atrogin-1和MuRF1在肌肉內(nèi)mRNA的表達(dá)，探討其與肌肉萎縮的相關(guān)性； (3)觀測肌肉內(nèi)MAFbx/Atrogin-1和MuRF1在術(shù)后不同時段蛋白水平的變化，探討其與肌肉萎縮的相關(guān)性； (4)探討肌肉內(nèi)MAFbx/Atrogin-1和MuRFl活化的可能機制。 方法： (1)建立大鼠單側(cè)吻合血管神經(jīng)的股薄肌原位游離移植動物模型，并按術(shù)后觀察時間

3、段的不向，分為術(shù)后1周、2周、3周、4周、5周、10周、15周、20周和30周組； (2)術(shù)后不同時間段的肌肉測量濕重，及移植側(cè)肌濕重/對照側(cè)肌濕重×100％，得出肌濕重維持率； (3)不同時間段移植側(cè)和對照側(cè)的肌肉近、中、遠(yuǎn)段組織做10μm橫切片，然后行HE染色，顯微鏡下拍照后。用NIH Image J v1.36軟件分析測量肌細(xì)胞直徑及截面積； (4)生理記錄儀分別測試各組移植前后的最大單收縮力和最大強直收縮

4、力。每側(cè)收縮力所得數(shù)值按移植后/移植前×100％計算，得出各組肌肉的恢復(fù)程度； (5)參考大鼠MAFbx/Atrogin-1和MuRF1基因編碼序列，采用PrimerPremier軟件設(shè)計反轉(zhuǎn)錄引物及PCR引物。采用SYBR Green實時定量PCR技術(shù)，檢測移植后不同時間肌肉內(nèi)MAFbx/Atrogin-1和MuRF1基因的轉(zhuǎn)錄水平，各組以GAPDH為內(nèi)參； (6)Western Blot檢測移植后不同時間肌肉內(nèi)MAF

5、bx/Atrogin-1蛋白的變化，各組以GAPDH為內(nèi)參；(7)SYBR Green實時定量PCR技術(shù)檢測移植術(shù)后不同時間IGF1 mRNA表達(dá)的變化；各組以GAPDH為內(nèi)參。 結(jié)果： (1)成功構(gòu)建了吻合血管神經(jīng)的大鼠股薄肌游離移植動物模型，各分組大鼠成活良好，無一死亡，獲取肌肉標(biāo)本無感染跡象。 (2)肌肉移植后，肌濕重維持率(移植側(cè)肌濕重/對照側(cè)肌濕重×100％)，先降低后增加，在術(shù)后第4周最低，達(dá)(59.

6、3±5.2)％，但到術(shù)后晚期時仍低于對照組的水平(P<0.05)。 (3)術(shù)后肌細(xì)胞橫截面積呈現(xiàn)相同的變化趨勢，先逐漸變小，至術(shù)后第四周時最低，然后又逐漸增加，同樣到術(shù)后30周時仍未恢復(fù)到術(shù)前對照組水平。 (4)測得術(shù)后移植肌肉的最大單收縮力和最大強直收縮力，與對照側(cè)比較得出肌肉功能恢復(fù)率后發(fā)現(xiàn)，與肌濕重維持率和肌細(xì)胞橫截面積的變化具有類似的趨勢。 (5)設(shè)計并合成了SYBR Green實時定量PCR技術(shù)所需的M

7、AFbx/Atrogin-1、MuRF1及GAPDH引物，通過常規(guī)PCR反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，擴增產(chǎn)物單一，無引物二聚體產(chǎn)生，引物特異性強。 (6)應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)，通過2<'-△△Cr>法計算移植后不同時間肌肉內(nèi)MAFbx/Atrogin-1和MuRF1基因的相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)MuRFl mRNA表達(dá)的相對量在術(shù)后逐漸增高，最高達(dá)3周時的4倍，而MAFbx/Atrogin-1 mRNA在術(shù)后的表達(dá)更為激烈，最到達(dá)2-3周時的7倍之多。

8、至術(shù)后15周時開始，MAFbx/Atrogin-1和MuRF1mRNA表達(dá)的相對量從最高又逐漸下降，開始為低度(1.1～1.5倍)高水平表達(dá)，但與對照側(cè)相比仍有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。發(fā)現(xiàn)MuRF1 mRNA表達(dá)的相對量在術(shù)后逐漸增高，最高達(dá)4周時的4倍，后逐漸較少，至術(shù)后15周開始為低度高水平表達(dá)；而MAFbx/Atrogin-1mRNA在術(shù)后的表達(dá)更為激烈，最高達(dá)到2-3周時的7倍之多，至術(shù)后15周也減少為低度的高水平表達(dá)。

9、 (7)Western Blot檢測移植后不同時間肌肉內(nèi)MAFbx/Atrogin-1蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)所有肌肉標(biāo)本的Western結(jié)果中，在分子量約為43KD的區(qū)域都可見MAFbx/Atrogin-1的蛋白條帶。以正常對照側(cè)肌肉內(nèi)目的蛋白表達(dá)量為對照，術(shù)后1周表達(dá)量有所下降，術(shù)后2周開始上升，4周左右達(dá)到最高，約正常對照的2.5倍。然后開始減少，術(shù)后15周時表達(dá)量仍較高，約為正常對照的1.35倍且與對照相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05

10、)，但到術(shù)后30周時移植的股薄肌內(nèi)的MAFbx/Atrogin-1蛋白表達(dá)量已與正常對照基本持平(P>0.05)。 (8)Realtime PCR檢測發(fā)現(xiàn)，術(shù)后IGF1 mRNA表達(dá)先降低后增高，與MAFbx/Atrogin-1和MuRF1mRNA表達(dá)的變化趨勢相反。 結(jié)論： (1)所構(gòu)建的吻合血管神經(jīng)的大鼠股薄肌游離移植動物模型符合研究需要，肌肉移植后肌濕重維持率和肌細(xì)胞橫截面積先呈現(xiàn)典型肌萎縮后表現(xiàn)，后隨神經(jīng)

11、的再支配，萎縮逐漸好轉(zhuǎn)，但至術(shù)后30周時仍未恢復(fù)到術(shù)前對照組水平； (2)用SYBR Green實時定量PCR技術(shù)，測量mRNA的表達(dá)相對量的方法可靠，靈敏度高，特異性強，重復(fù)性好；該方法檢測到的肌肉移植后MAFbx/Atrogin-1和MuRF1基因的表達(dá)變化，與肌肉游離移植后的萎縮及功能降低有密切關(guān)系； (3)Western Blot發(fā)現(xiàn)MAFbx/Atrogin-1蛋白有類似的變化趨勢，進一步證明了其與移植后肌萎縮