布病臨床診斷試劑盒的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：布氏菌病臨床診斷試劑盒的基礎(chǔ)研究。 方法：采用基因重組技術(shù)分別克隆編碼布氏桿菌抗原omp10、bp26的DNA片段，繼而分別構(gòu)建原核表達(dá)載體PET-30a(+)并轉(zhuǎn)化于大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)各重組蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步經(jīng)包涵體的變性復(fù)性、親和層析法對(duì)OMP10、BP26重組蛋白抗原進(jìn)行純化，Western-blot檢測(cè)其抗原性。然后用布氏減毒活疫苗104M、16M死菌液免疫Balb/c小鼠，制備高效價(jià)的血清

2、。選抗原性好的BP26重組蛋白作為包被抗原，通過(guò)間接ELISA法，檢測(cè)陽(yáng)性血清，證實(shí)其敏感性和特異性。 結(jié)果： 1、通過(guò)PCR克隆的BP26、OMP1O蛋白基因均與Genbank中的相應(yīng)的DNA序列一致。將克隆片段分別插入到表達(dá)載體PET-30a(+)上，得到重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了BP26、OMP1O蛋白。通過(guò)親和層析方法對(duì)重組蛋白BP26進(jìn)行了純化，獲得了高純度的重組蛋白；

3、理化特性的研究結(jié)果顯示：BP26分子量大小為27.8KD，在蛋白梯度純化圖中顯示：用100％B洗脫時(shí)，該蛋白在280nm附近有最大吸收。經(jīng)Western-Blot檢測(cè)表明該重組蛋白具有良好的抗原性。通過(guò)對(duì)包涵體的變性、復(fù)性以及親和層析等方法對(duì)OMP10蛋白進(jìn)行了純化，獲得了純度較高的重組蛋白；理化性質(zhì)的研究結(jié)果顯示：OMP10分子量為14.2KD，在蛋白梯度純化圖中顯示：在20％B、50％B、100％B洗脫時(shí)，都能監(jiān)測(cè)到該蛋白在280n

4、m附近的吸收峰。 2、本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠腹股溝皮下注射途徑，制備布氏桿菌陽(yáng)性血清(104M組、M16組)和陰性血清(百白破組、生理鹽水組)，通過(guò)雙向瓊脂免疫擴(kuò)散方法測(cè)血清效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到1:16或1:32時(shí)，即可摘眼球采血，收集血清。用BP26重組蛋白包被抗原，間接ELISA結(jié)果P/N比值遠(yuǎn)高于2.1，說(shuō)明：布病患者血清、小鼠104M血清、小鼠16M血清和沙林鼠種免兔血清與BP26蛋白特異性結(jié)合，敏感度強(qiáng)。此外，用BP26重組蛋