BALB-c小鼠潰瘍性結(jié)腸炎遠(yuǎn)段結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞分布及超微結(jié)構(gòu)變化的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景及目的 Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC)廣泛分布于消化道，是胃腸慢波活動(dòng)的起搏細(xì)胞及其基本電節(jié)律的主要傳播細(xì)胞，并參與胃腸道神經(jīng)信息的傳遞。近年研究表明，ICC與眾多胃腸道疾病關(guān)系密切，其分布異常、數(shù)目減少及超微結(jié)構(gòu)改變可能是這些疾病發(fā)病的重要病理生理機(jī)制之一。 潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種非特異性結(jié)腸、直腸炎性疾病，病變主要

2、局限于粘膜與粘膜下層。迄今為止，UC病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，一般認(rèn)為與免疫、過敏、遺傳及非特異性感染等因素有關(guān)。近年研究顯示，UC患者腸壁ICC可發(fā)生不同程度缺失、減少及發(fā)生超微結(jié)構(gòu)改變[3]，可能影響神經(jīng)信號(hào)傳遞及平滑肌細(xì)胞（smooth mucle cell，SMC）功能，從而引起疾病伴發(fā)的腸運(yùn)動(dòng)功能障礙。 近年，UC在我國(guó)發(fā)病率呈升高趨勢(shì)，因此建立合適的動(dòng)物模型，進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)UC發(fā)病機(jī)制和開發(fā)治療藥物有重要意義。多項(xiàng)

3、研究表明，葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium, DSS）誘導(dǎo)的BALB/c小鼠UC模型具有簡(jiǎn)單易行，成功率高，重復(fù)性好，適用范圍廣，與人類UC病變類似等優(yōu)點(diǎn)[4,5]。但迄今為止，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未見有關(guān)UCBALB/c小鼠結(jié)腸或直腸ICC分布及超微結(jié)構(gòu)變化的研究。本實(shí)驗(yàn)通過DSS 法建立BALB/c 小鼠急、慢性UC 動(dòng)物模型，觀察UC小鼠遠(yuǎn)段結(jié)腸組織中ICC 分布和超微結(jié)構(gòu)變化，并與人類UC 結(jié)腸ICC 分布和超微

4、結(jié)構(gòu)變化相比較，進(jìn)一步探討UC 發(fā)病與ICC 分布和超微結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系，同時(shí)深入比較BALB/c 小鼠UC 動(dòng)物模型結(jié)腸病理改變與人類UC 病理改變情況的相似性，為BALB/c 小鼠UC 動(dòng)物模型是否可以有效用于研究UC 發(fā)病機(jī)制和藥物治療提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 第一部分：BALB/c小鼠急、慢性UC動(dòng)物模型的制備和鑒定。根據(jù)Cooper等的方法建立急、慢性DSS小鼠UC模型：①將DSS溶于蒸餾水，配制成5％DS

5、S溶液，讓BALB/c小鼠自由飲用7d，建立小鼠急性UC模型； BALB/c ②小鼠自由飲用5％DSS溶液7d，然后飲用不含DSS的蒸餾水14d，建立小鼠慢性UC模型；③將僅飲用蒸餾水的BALB/c小鼠作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)過程中觀察小鼠每日體重、大便性狀和隱血情況，以及結(jié)腸大體形態(tài)和病理改變。分別取三組小鼠遠(yuǎn)段結(jié)腸組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，行組織病理學(xué)鑒定。 第二部分：BALB/c 小鼠UC 遠(yuǎn)段結(jié)腸Cajal 間質(zhì)細(xì)

6、胞分布的觀察。分別取三組小鼠遠(yuǎn)段結(jié)腸組織標(biāo)本，制備冰凍切片，采用酪氨酸激酶受體（c-kit）抗體免疫熒光組織化學(xué)法觀察ICC 分布，應(yīng)用OLYMPUS FV1000 激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行c-kit 熒光定量表達(dá)檢測(cè)。 第三部分：BALB/c 小鼠UC 遠(yuǎn)段結(jié)腸Cajal 間質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察。 分別取三組小鼠遠(yuǎn)段結(jié)腸組織標(biāo)本，固定、脫水、包埋，常規(guī)超薄切片，采用硝酸鉛、醋酸鈾染色，JEM-2000EX 透射電子顯微鏡觀

7、察。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、成功制備BALB/c小鼠急、慢性UC動(dòng)物模型，并經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)。 2、免疫熒光和激光共聚焦熒光定量結(jié)果：⑴正常對(duì)照組BALB/c 小鼠遠(yuǎn)段結(jié)腸組織中ICC 主要分布于粘膜下叢（IC-SM）和肌間叢（IC-MY），IC-MY在切面上幾乎呈現(xiàn)連續(xù)性分布，相互連接形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。⑵急性UC 組小鼠遠(yuǎn)段結(jié)腸組織內(nèi)ICC的分布較正常對(duì)照組和慢性UC組小鼠顯著減少（P＜0.001)，IC-MY 的網(wǎng)絡(luò)狀

8、結(jié)構(gòu)完全破壞，殘存ICC 形態(tài)也出現(xiàn)異常。⑶慢性UC 組小鼠遠(yuǎn)段結(jié)腸組織內(nèi)ICC 的分布較正常對(duì)照組減少（P＜0.05)，但較急性UC 組顯著增加（P＜0.001），其形態(tài)接近正常，但I(xiàn)C-MY的連續(xù)性分布不明顯，未能形成正常的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。 3、透射電子顯微鏡觀察結(jié)果：⑴正常對(duì)照組BALB/c 小鼠遠(yuǎn)段結(jié)腸ICC 超微結(jié)構(gòu)主要特點(diǎn)：細(xì)胞呈紡錘形，有巨大的卵圓形核及向外伸展的長(zhǎng)突起，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的線粒體、大量光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

9、；環(huán)肌層和縱肌層ICC 與腸神經(jīng)元之間形成突觸樣連接。⑵急性UC 組小鼠遠(yuǎn)段結(jié)腸ICC 超微結(jié)構(gòu)改變：細(xì)胞體積增大，線粒體腫脹、電子密度降低，溶酶體數(shù)目增多，出現(xiàn)次級(jí)溶酶體；部分ICC 胞漿內(nèi)可見大量脂滴；IC-SM 周圍出現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞。⑶慢性UC 組小鼠遠(yuǎn)段結(jié)腸ICC 超微結(jié)構(gòu)改變：細(xì)胞形態(tài)基本正常，線粒體形態(tài)基本正常或輕度腫脹，溶酶體數(shù)目增多，以初級(jí)溶酶體為主；IC-SM 周圍巨噬細(xì)胞數(shù)目較少，可見較多透明小泡。 結(jié)論