芪丹通脈片抑制缺血-再灌注心肌損傷作用及其信號(hào)通路機(jī)制.pdf

1、急性心肌梗死后，通過藥物溶栓、血管成形術(shù)等方法快速恢復(fù)心肌血流的再灌注策略對于挽救可用性心肌是必要的。然而，再灌注可加重缺血心肌損傷，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的丟失和功能恢復(fù)障礙。研究結(jié)果顯示：缺血/再灌注心肌損傷(I/RI)的機(jī)制與防治方法是將來一段時(shí)間內(nèi)需要解決的重要問題。凋亡是再灌注過程中導(dǎo)致心肌細(xì)胞丟失的重要病理形式。抑制凋亡能夠減輕再灌注心肌損傷，促進(jìn)心功能的恢復(fù)。缺血預(yù)處理和缺血后處理能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡，縮小心肌梗死面積，減少心律失

2、常的發(fā)生。該類現(xiàn)象為防治缺血/再灌注心肌損傷策略的研究提供了切入點(diǎn)，而其共同的細(xì)胞內(nèi)分子信號(hào)通路--再灌注損傷存活激酶(RISK)通路機(jī)制的關(guān)鍵分子可能成為防治I/RI 策略的新的靶點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)能夠模擬上述兩種現(xiàn)象的保護(hù)性藥物受到廣泛關(guān)注。探討藥物保護(hù)作用與RISK 通路活化的相關(guān)性不僅能從分子水平認(rèn)識(shí)藥物的作用機(jī)制，而且能夠?yàn)樗幬镌谂R床準(zhǔn)確有效的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 應(yīng)用中藥防治I/RI 及其作用機(jī)制的研究是近年來中西結(jié)合心血管疾

3、病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：多種中藥制劑具有保護(hù)心肌、抑制I/RI作用。其作用機(jī)制可能與抑制鈣超載，抑制炎性反應(yīng)，清除氧自由基等有關(guān)，但其信號(hào)通路機(jī)制尚不清楚。 芪丹通脈片由黃芪、丹參、當(dāng)歸、紅花、桂枝等中藥組成，具有益氣活血，化瘀通脈的功效，能夠保護(hù)缺血心肌。本研究在觀察芪丹通脈片對大鼠I/RI 模型心肌的保護(hù)作用基礎(chǔ)上，探索該中藥復(fù)方對I/RI 中心肌細(xì)胞凋亡及其效應(yīng)分子的影響，并對該中藥復(fù)方對RISK 通路的影響

4、及其保護(hù)作用與RISK 通路的相關(guān)性進(jìn)行研究。 1、芪丹通脈片 對大鼠缺血/再灌注心肌損傷的影響雄性SD 大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、不同劑量芪丹通脈片組。 分組干預(yù)7d 后，通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左降支40min 后再灌注4h 成功復(fù)制心肌I/RI 模型。采用Evan’s Blue 和TTC 染色測定心肌梗死范圍，并檢測血清中肌酸激酶（creatine kinase，CK）和肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac tro

5、poninⅠ,cTnⅠ)，觀察比較不同劑量的芪丹通脈片預(yù)處理對大鼠心肌I/RI 的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 不同劑量(1.08g/kg,3.24g/kg)芪丹通脈片預(yù)處理，缺血/再灌注后心肌梗死面積分別為36.7±8.9％和28.8±8.4％,顯著低于模型組(49.1±10.3％； P﹤0.05; P﹤0.01);缺血/再灌注4h 后模型組大鼠血清中的CK和cTnI分別為12801.84±4102.70u/L 和64.89±13.03

6、ng/mL，與假手術(shù)組存在顯著差異(1552.83±451.07u/L 和1.40±0.64ng/mL，P﹤0.01；P﹤0.01)；而不同劑量芪丹通脈片預(yù)處理組再灌注后血清中CK 和cTnI 的含量分別為10017.17±3345.46 u/L 與47.23±12.76 ng/mL 和6973.50±1778.40u/L 與35.13±14.42ng/mL，與模型組比較存在顯著差異( P﹤0.05; P﹤0.01)。以上結(jié)果表明：芪丹

7、通脈片預(yù)處理能夠誘導(dǎo)大鼠心肌對I/RI 的耐受，有效地抑制缺血/再灌注所致大鼠心肌損傷。 2、芪丹通脈片對缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白的影響 應(yīng)用上述實(shí)驗(yàn)中I/RI 模型和分組方案，采用TUNEL 法檢測并計(jì)算I/RI心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)；化學(xué)比色法測定心肌組織中的NOS 活性；免疫組化檢測心肌組織中Bcl-2 和Bax 蛋白的表達(dá)；Western blot 測定心肌組織中ERK1/2和p- ERK1/2 的表達(dá)

8、。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同劑量芪丹通脈片(1.08g/kg,3.24g/kg)預(yù)處理可抑制I/RI 中心肌細(xì)胞凋亡，其凋亡指數(shù)分別為14.3±3.8％和10.6±2.0％,與模型組(21.3±4.2％)比較均存在顯著性差異( P﹤0.05; P﹤0.01)。 心肌組織中的iNOS 活性顯著高于假手術(shù)組(0.7484±0.1906U/mgprot vs0.3454±0.1362 U/mgprot, P<0.01)，不同劑量芪丹通脈片預(yù)處理

9、后可降低再灌注后iNOS 的活性,以芪丹通脈片(3.24g/kg)組顯著(0.4204±0.1351U/mgprot vs0.7484±0.1906U/mgprot, P<0.01)；與模型組比較，不同劑量的芪丹通脈片預(yù)處理后均能夠顯著增加cNOS 活性(0.5827±0.1680U/mgprot vs0.3010±0.0617U/mgprot, P<0.05 ； 0.7618±0.2077U/mgprot vs 0.3010±0.06

10、17U/mgprot, P<0.01)。手術(shù)組中NOS 活性均較假手術(shù)組增高，但芪丹通脈片預(yù)處理組中NOS 的活性與模型組無差異性差異（P>0.05）免疫組化研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)組中Bcl-2和Bax均有少量表達(dá)，模型組較假手術(shù)組Bcl-2 和Bax 表達(dá)明顯增加，平均灰度質(zhì)明顯下降(P<0.05；P<0.01)。模型組Bcl-2平均灰度質(zhì)為165.17±9.21；不同劑量芪丹通脈片1.08，3.24g/kg 預(yù)處理后缺血/再灌注心肌組

11、織中Bcl-2 的平均灰度值分別為147.82±19.51 和118.65±16.31，平均灰度較模型組明顯降低(P<0.05；P<0.01)； 模型組Bax 平均灰度值為139.43±11.70，芪丹通脈片(1.08，3.24g/kg)預(yù)處理后Bax-2 的平均灰度值分別為151.67±16.69 和160.71±19.82，二者的灰度值與模型組比較有降低，但無顯著性差異。 通過Western blot 檢測芪丹通

12、脈片預(yù)處理對I/RI 大鼠心肌ERK 1/2 和磷酸化ERK1/2 表達(dá)的影響，結(jié)果顯示：芪丹通脈片組中ERK1/2 的表達(dá)水平與假手術(shù)組、模型組中的表達(dá)水平無顯著差異( P﹥0.05)；芪丹通脈預(yù)處理組中pERK1/2 的表達(dá)水平明顯增加；其中3.24g/kg 芪丹通脈預(yù)處理組與模型組比較，pERK1/2 增加2.1 倍(503.75±102.76 a.u vs 244.25±146.00 a.u , P<0.01)。 以上

13、研究結(jié)果表明：芪丹通脈片預(yù)處理能夠減少缺血/再灌注心肌細(xì)胞的凋亡，這種抗凋亡的作用機(jī)制與改變心肌組織中不同NOS 活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞中抗凋亡蛋白的表達(dá)有關(guān)。芪丹通脈片對這些分子的調(diào)節(jié)效應(yīng)與通過其增強(qiáng)磷酸化ERK1/2 的表達(dá)水平、提高該蛋白激酶的活性可能存在相關(guān)性。 3、芪丹通脈片抑制缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡與PI3K/Akt 相關(guān)性的研究 SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、芪丹通脈片組和芪丹通脈片加PI3K/Akt

14、 抑制劑組。I/RI 大鼠模型復(fù)制方法同前，用TUNEL 法檢測并計(jì)算再灌注后心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，Western blot 測定心肌組織中PI3K/Akt 蛋白激酶的表達(dá)和活性，觀察再灌注前給與PI3K/Akt 通路特異性抑制劑LY294002對芪丹通脈片預(yù)處理組保護(hù)心肌、抑制再灌注損傷作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 芪丹通脈片預(yù)處理可使再灌注心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)從模型組的20.3±4.5％減少至11.6±2.3％，二者存在顯著差異( P﹤

15、0.01)。再灌注前給于相應(yīng)溶媒的假手術(shù)組，模型組和芪丹通脈片預(yù)處理組與再灌注前應(yīng)用LY294002 的芪丹通脈片預(yù)處理組中心肌組織中PI3K，Akt 的表達(dá)水平無顯著性差異，芪丹通脈片預(yù)處理組中心肌組織pAkt 表達(dá)水平2.5 倍，再灌注前給與LY294002 的芪丹通脈片預(yù)處理組凋亡指數(shù)較芪丹通脈片預(yù)處理組增加，兩者存在顯著差異(17.0±5.5％ vs 11.6±2.3％， P﹤0.05)，與模型組凋亡指數(shù)(20.3±4.5％)比

16、較沒有顯著性差異( P﹥0.05)，同時(shí)抑制芪丹通脈片預(yù)處理誘導(dǎo)增加的p-Akt 的表達(dá)水平。 以上結(jié)果表明：抑制p-Akt 的表達(dá)水平阻斷芪丹通脈片預(yù)處理的抗凋亡效果，PI3K/Akt 信號(hào)活化是芪丹通脈片抑制缺血/再灌注所致的心肌細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)途徑。 綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)了芪丹通脈片預(yù)處理對I/R 大鼠心肌的保護(hù)作用。這種保護(hù)作用與芪丹通脈片調(diào)節(jié)心肌組織中不同NOS 活性和增加抗凋亡蛋白的表達(dá)有關(guān)，而芪丹