殼聚糖-磷酸甘油-慶大霉素凝膠系統(tǒng)經(jīng)圓窗龕局部給藥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分殼聚糖-磷酸甘油-慶大霉素凝膠圓窗龕局部給藥治療梅尼埃病的有效性及安全性研究
　　 研究目的:
　　 目前利用慶大霉素(GT)耳毒性，治療梅尼埃病眩暈，得到越來(lái)越多的耳科醫(yī)生的關(guān)注。慶大霉素內(nèi)耳局部給藥用于治療梅尼埃病，操作簡(jiǎn)單，療效確切。由于給藥濃度及劑量的不同，不同研究表明，慶大霉素除了發(fā)揮對(duì)前庭毛細(xì)胞的破壞作用外，其對(duì)內(nèi)耳毛細(xì)胞亦有不同程度的損傷。該研究應(yīng)用殼聚糖-磷酸甘油(CGP)凝膠攜帶慶大霉素，通過(guò)圓

2、窗龕給藥的方式，可控及緩釋地將慶大霉素釋放進(jìn)入內(nèi)耳，與傳統(tǒng)鼓室內(nèi)注射慶大霉素相比，評(píng)估其治療梅尼埃病的安全性及有效性。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 聽(tīng)力及前庭功能正常的C57BL/6J小鼠（6-8周）24只，隨機(jī)分成3組，A組為經(jīng)鼓膜穿刺隔日注射慶大霉素硫酸鹽(6mg/ml，10ul)組;B組為經(jīng)鼓膜穿刺隔2日注射慶大霉素硫酸鹽(6mg/ml，l0ul)組;C組為應(yīng)用CGP凝膠緩釋系統(tǒng)經(jīng)圓窗龕釋放慶大霉素(300mg/ml，

3、0.2ul)組。A、B組小鼠均接受2周重復(fù)藥物注射，C組小鼠僅接受1次圓窗龕給藥。聽(tīng)力學(xué)評(píng)估:在注射前及注射后14天，采應(yīng)用腦干誘發(fā)電位(ABR)評(píng)估小鼠的聽(tīng)力變化情況;前庭功能評(píng)估:在注射前及注射后的14天內(nèi)，每天進(jìn)行垂直轉(zhuǎn)鼓實(shí)驗(yàn)，評(píng)估小鼠的前庭功能變化情況。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 ABR檢測(cè)示:在注射后的第14天，A組小鼠ABR閾值在16kHz、24kHz、32kHz、40kHz均比用藥前明顯提高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)

4、意義(p＜0.05);B組小鼠在注射后第14天，僅有40kHzABR閾值較注射前顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.030，p＜0.05)，其余頻率，ABR閾值均未見(jiàn)明顯提高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);C組小鼠各頻率ABR閾值較注射前均無(wú)顯著提高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 垂直轉(zhuǎn)鼓實(shí)驗(yàn)示:A組小鼠在術(shù)后第10天的保持時(shí)間比術(shù)前明顯降低(p=0.031，p＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在術(shù)后第14天的保

5、持時(shí)間與術(shù)前相比無(wú)明顯差異(p=0.105，p＞0.05)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;B組小鼠在術(shù)后所有時(shí)間點(diǎn)均與術(shù)前數(shù)據(jù)無(wú)顯著性差異(p＞0.05);C組小鼠的平均保持時(shí)間在術(shù)后第6天、第10天與術(shù)后第14天均明顯低于術(shù)前（p值分別為0.041，0.034，0.006;p值均＜0.05）。C組小鼠的平均保持時(shí)間在術(shù)后14天明顯低于A組(p=0.019;p＜0.05)和B組(p=0.016;p＜0.05)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　

6、殼聚糖-磷酸甘油(CGP)凝膠緩釋系統(tǒng)攜帶慶大霉素進(jìn)入內(nèi)耳，可以造成持續(xù)而穩(wěn)定的前庭功能下降，而不引起顯著的聽(tīng)覺(jué)功能下降，較之傳統(tǒng)的鼓室注射治療，其是一種安全而有效的內(nèi)耳緩釋給藥系統(tǒng)，有良好的臨床應(yīng)用前景。
　　 第二部分
　　 殼聚糖-磷酸甘油-慶大霉素凝膠經(jīng)圓窗龕給藥后慶大霉素在內(nèi)耳毛細(xì)胞的分布
　　 研究目的:
　　 目前利用慶大霉素耳毒性，治療梅尼埃病眩暈，得到越來(lái)越多的耳科醫(yī)生的關(guān)注。慶大霉素內(nèi)

7、耳局部給藥用于治療梅尼埃病，操作簡(jiǎn)單，療效確切。但是由于直接注射慶大霉素至中耳后，不能準(zhǔn)確地控制與圓窗膜接觸的藥量，而且部分藥液通過(guò)咽鼓管排除中耳腔，或被中耳腔粘膜吸收，因此導(dǎo)致進(jìn)入內(nèi)耳的慶大霉素的劑量有很大波動(dòng)性，因此也產(chǎn)生了很大的療效差異。為克服現(xiàn)有方法的局限，建立一種安全有效并且方便的給藥模式，使其能夠在單次應(yīng)用后，即可持續(xù)緩慢地釋放慶大霉素至內(nèi)耳，我們建立了殼聚糖-磷酸甘油凝膠系統(tǒng)應(yīng)用于慶大霉素內(nèi)耳局部給藥。前期研究通過(guò)與傳統(tǒng)鼓

8、室內(nèi)注射的對(duì)照，已經(jīng)證明殼聚糖-磷酸甘油-慶大霉素凝膠在小鼠圓窗龕局部注射后，緩釋?xiě)c大霉素至內(nèi)耳的能力，及其對(duì)耳蝸、前庭系統(tǒng)功能的影響。但是對(duì)于此緩釋凝膠攜帶慶大霉素進(jìn)入內(nèi)耳后，慶大霉素在內(nèi)耳的分布情況，我們尚不清楚，因此，此實(shí)驗(yàn)的目的是研究慶大霉素在該緩釋凝膠系統(tǒng)的緩釋作用下，在內(nèi)耳毛細(xì)胞中如何分布的，以及如何影響內(nèi)耳毛細(xì)胞的形態(tài)及功能的。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 將硫酸慶大霉素(gentamicin，GT)和德州紅(

9、texasred，TR)混合后置于37°攪拌過(guò)夜使其結(jié)合形成慶大霉素德州紅螯合物(gentamicin-texasred，GTTR)，然后將GTTR與殼聚糖-磷酸甘油凝膠(CGP)混合形成殼聚糖-磷酸甘油-慶大霉素凝膠(CGP-GTTR-hydrogel)。通過(guò)耳后入路暴露小鼠左側(cè)耳蝸圓窗龕，取0.5ul該凝膠注入圓窗龕內(nèi)，讓其左耳向上平臥半小時(shí)待膠體凝固。分別于凝膠注射后1天及7天，采取心臟灌注4％多聚甲醛的方式處死小鼠，快速將其耳蝸

10、取下，蝸內(nèi)灌注固定液，固定2小時(shí)后，解剖其基底膜、橢圓囊斑及球囊斑，用Phalloidin-Alexa-488進(jìn)行染色，進(jìn)行鋪片，使用Leica激光共聚焦顯微鏡觀察分析，Phalloidin與GTTR使用紅綠雙色熒光通道進(jìn)行掃描觀察，選擇一定的區(qū)域進(jìn)行熒光半定量分析，測(cè)定得到的平均像素強(qiáng)度即為熒光強(qiáng)度。觀察慶大霉素在內(nèi)耳的分布規(guī)律及毛細(xì)胞的形態(tài)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 在前庭系統(tǒng)中，經(jīng)圓窗龕局部注射殼聚糖-磷酸甘油-慶

11、大霉素凝膠1天后，紅色顆粒狀GTTR熒光主要位于球囊斑上的毛細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，其熒光強(qiáng)度在注射后1天和7天分別是14.13±4.09，4.69±1.76，注射后7天時(shí)的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于注射后1天時(shí)的熒光強(qiáng)度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。另外，注射后1天時(shí)表皮板表面的纖毛束明顯多于注射后7天時(shí)的纖毛束。
　　 在耳蝸系統(tǒng)中，經(jīng)圓窗龕局部注射殼聚糖-磷酸甘油-慶大霉素凝膠1天后，可觀察到紅色顆粒狀GTTR熒光主要位于耳蝸基底膜的底轉(zhuǎn)

12、及中轉(zhuǎn)，其熒光強(qiáng)度分別為51.59±6.42，20.64±4.14，底轉(zhuǎn)強(qiáng)度明顯強(qiáng)于中轉(zhuǎn)熒光強(qiáng)度(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣地，在注射凝膠7天后，紅色顆粒狀GTTR熒光仍然位于耳蝸基底膜的底轉(zhuǎn)及中轉(zhuǎn)，其熒光強(qiáng)度分別為43.01±3.61，12.17±2.43，底轉(zhuǎn)強(qiáng)度明顯強(qiáng)于中轉(zhuǎn)熒光強(qiáng)度(p＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在凝膠注射后的1天和7天，耳蝸的頂轉(zhuǎn)均未見(jiàn)到紅色顆粒狀熒光。同時(shí)，比較耳蝸底轉(zhuǎn)在注射后1天和7天的熒光強(qiáng)

13、度可見(jiàn)，注射后1天的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于注射后7天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;同樣比較耳蝸中轉(zhuǎn)在注射后1天和7天的熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)同樣的規(guī)律，注射后1天的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于注射后7天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。另外，在注射后7天，耳蝸底轉(zhuǎn)部分外毛細(xì)胞缺失，但是在注射后1天和7天，在耳蝸的頂轉(zhuǎn)及中轉(zhuǎn)均未見(jiàn)毛細(xì)胞的缺失。
　　 研究結(jié)論:
　　 該研究探討了慶大霉素通過(guò)該凝膠緩釋系統(tǒng)釋放進(jìn)入內(nèi)耳后，慶大霉素在內(nèi)耳的分布