顱腦損傷后代謝型谷氨酸受體1a（mGluR1a）表達及競爭性拮抗劑1-氨基茚-1，5-二羧酸（AIDA）作用研究.pdf

1、顱腦損傷是神經(jīng)外科常見疾病之一,其發(fā)病率及致死、致殘率均較高,是危害身心健康的主要疾病之一.急性腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元損傷可分為兩種形式,一種稱為原發(fā)性神經(jīng)元損傷,是損傷暴力對神經(jīng)元的機械損傷,在創(chuàng)傷的同時發(fā)生;另一種稱為遲發(fā)性神經(jīng)元損傷,主要表現(xiàn)為興奮性毒性死亡和凋亡兩種形式,由多種因素引起,在創(chuàng)傷后幾小時、幾天甚至更長時間后發(fā)生.谷氨酸(Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一,顱腦損傷可引起Glu的過量釋放,激活Glu受體.Glu通

2、過離子型谷氨酸受體(iGluRs)和代謝性谷氨酸受體(mGluRs)作用于神經(jīng)元.但目前的研究主要集中在iGluRs,而關(guān)于m GluRs在腦損傷病理生理中的作用卻知之甚少.代謝型谷氨酸受體是一類與G蛋白耦聯(lián)的調(diào)節(jié)離子通道和第二信使生成酶的特異受體,存在的多種亞型反映出它們在功能上的多樣性和復雜性,不同亞型的受體具有不同的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制.它們對谷氨酸介導的突觸傳遞的調(diào)節(jié)作用可以表現(xiàn)為增強作用,也可以表現(xiàn)為抑制效應,最終效應取決于局部神

3、經(jīng)環(huán)路的構(gòu)成.依據(jù)mGluRs序列同源性信號傳導機制和藥理學敏感性將該受體分為3組共8種亞型,第Ⅰ組包括mGluRl(mGluRla、b、c、d、e)和mGluR5(mGlu.R5a和b),與Gq蛋白偶聯(lián);第Ⅱ組受體包括mGluR2和mGluR3,與Gi蛋白偶聯(lián);第Ⅲ組谷氨酸受體包括mGluR4(mGluR4a和4b),mGluR6,.mGluR7(mGluR7a和7b)和mGluR8(:mGluR8a和8b),與Gi蛋白偶聯(lián).一系列研

4、究顯示,大鼠彌漫性腦損傷后腦皮層內(nèi)3組mGluRs表達均有改變但以mGluRl變化最為顯著,是加重神經(jīng)元損傷的主導因素.mGluRl激活后通過使PLC活化,促使磷脂酰肌醇(PI)水解為三磷酸肌醇(IP3)與二?；视?DAG),二者均為胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的第二信使. 多年來學者們致力于顱腦損傷生理病理機制、實驗性治療的研究,建立了多種在體及體外顱腦損傷模型.由于體外研究模型能夠排除體內(nèi)損傷過程中一些復雜因素的影響,并具有能夠選擇性的

5、觀察單因素對某種類型細胞的影響的優(yōu)點,近年來日益受到研究者的重視.在本實驗中我們建立了一種新的體外培養(yǎng)大鼠腦皮層神經(jīng)元機械損傷模型,并在該模型的基礎(chǔ)上探討損傷前后mGluRla的表達及其拮抗劑AIAD的作用和意義.此外,我們在自由落體損傷模型的基礎(chǔ)上探討傷后不同時間大鼠大腦皮層m GIuRla表達的變化及其拮抗劑AIAD的作用和意義.實驗共分三個部分: 第一部分:體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元機械性損傷模型的建立 目的:介紹一種

6、較為簡單的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)方法并在此基礎(chǔ)上建立體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元機械性損傷模型. 方法:出生24小時以內(nèi)的SD大鼠皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng),針頭機械性劃傷培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元,依劃傷程度不同分為輕度和重度損傷2組,對照組除不進行劃傷處理外,其余處理同損傷組.傷后不同時間點檢測皮層神經(jīng)元存活率及培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(LDH)含量. 結(jié)論:體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元機械性損傷模型操作簡便,重復性好,能模擬顱腦損傷后神經(jīng)元損傷過程,可控制

7、損傷程度;是一種較好的體外神經(jīng)元機械性損傷模型. 第二部分:皮層神經(jīng)元機械性損傷后mGluRla的表達規(guī)律及其競爭性拮抗劑AIDA的保護作用 目的: 研究體外培養(yǎng)大鼠腦皮層神經(jīng)元機械性損傷后mGluRla的表達規(guī)律及其競爭性拮抗劑AIDA的保護作用. 方法:出生24小時以內(nèi)的SD大鼠皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)7天,隨機分為創(chuàng)傷組和AIDA組;以針頭造成細胞機械性損傷,AIDA處理組在損傷前30分鐘每孔加入AIDA20μm

8、ol;RT-PCR和Western blotting 法檢測損傷前后體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元mGluRla的表達;傷后不同時間點行神經(jīng)元免疫組化染色;傷后不同時間點留取創(chuàng)傷組及治療組培養(yǎng)液上清檢測LDH含量;采用Fura-2/AM雙波長熒光法測定損傷前后神經(jīng)元細胞內(nèi)游離Ca<'2+>濃度變化,同時測定接受AIDA治療的神經(jīng)元細胞內(nèi)游離Ca<'2+>濃度. 結(jié)論: 體外培養(yǎng)大鼠腦皮層神經(jīng)元機械性損傷后mGluRla表達明顯增強,創(chuàng)傷引起

9、的神經(jīng)細胞內(nèi)游離Ca<'2+>濃度升高可被mGluRsla拮抗劑AIDA阻斷,AIDA有顯著的神經(jīng)保護作用. 第三部分:急性彌漫性腦損傷后神經(jīng)元mGluRla的表達規(guī)律及其競爭性拮抗劑AIDA的保護作用 目的:研究大鼠急性腦損傷后大腦皮層mGluRla的基因表達變化與其拮抗劑AIDA的作用. 方法:SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、單純損傷組、生理鹽水治療組(NS)和AIDA治療組共4組,參照Marmarou自由落體方

10、法制作彌漫性腦損傷(DBI)模型,治療組大鼠在損傷前30分鐘經(jīng)側(cè)腦室注射生理鹽水或AIDA溶液10μ1;假手術(shù)組和單純打擊組大鼠在傷后不同時間斷頭取腦進行RT-PCR、HE染色、腦組織含水量測定和免疫組化研究;治療組大鼠傷后不同時間斷頭取腦進行腦組織含水量測定和免疫組化研究,在傷后1天、1周及2周進行大鼠神經(jīng)功能評分(NSS). 結(jié)論: mGluRla參與腦外傷后的繼發(fā)性神經(jīng)元損傷,其競爭性拮抗劑AIDA可改善損傷大鼠預后,對急